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分光光度计法 测定果胶酶活力的方法研究
时间:2018-10-18 点击次数:763

果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称, 它可分 为内切型和外切型两大类。果胶酶广泛应用于果品的 加工工业中, 主要作用是果品榨汁时降低果浆泥的粘 稠度, 提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和稳定性 等。果胶酶的活力对果品的加工品质影响很大, 因此 测定果胶酶的活力显得尤为重要。测定酶活力的方 法主要有还原法、色原底物法、粘度法等, 其中还原 法中的 3,5 一二硝基水杨酸比色法( 简称 DNS 法) 具 有操作简便, 对试剂、仪器等条件要求不高等优点。 该方法是利用果胶酶在一定温度、时间和条件下水 解果胶, 释放出还原性 D- 半乳糖醛酸, 与 3,5 一二硝 基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 即发生显 色反应。在一定范围内, 水解生成 D- 半乳糖醛酸的 量与吸光度成正比[1~2], 与果胶酶活力成正比, 通过分光光度计测定吸光度, 可以计算出果胶酶的活力。该 方法( 又称分光光度计法) 简单易行, 但操作中影响 因素较多, 往往影响测定结果的准确性。本研究就测 定中各影响因素进行了优化实验, 试图提出果胶酶 活力测定的技术参数。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 乙 酸 钠 (CH3 COONa·3H2O)、 冰 乙 酸 (CH3 COOH)、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠 (C4H4KNaO6·4H2O)、苯酚 以上试剂均为市售分析 纯;3, 5 一二硝基水杨酸 ;D- 半乳糖醛酸 97%,;果 胶、果胶酶  实验用水 均为 去离子水。UV1800PC; 电热恒温 水浴锅  1.2 实验方法 1.2.1 试剂配制 1.2.1.1 乙酸一乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8) 首先制备 0.2mol/L 的乙酸溶液和 0.2mol/L 的乙酸钠溶液, 然 后将 0.2mol/L 乙酸溶液 410.0mL 与 0.2mol/L 乙酸 钠溶液 590.0mL 混合均匀, 用酸度计测定。 1.2.1.2 DNS 试剂 (3g/L) 称取 3.00g 3,5 一二硝基水 杨酸, 溶解于 500mL 蒸馏水中, 再逐步加入 10.4g NaOH、 91.0g C4H4KNaO6·4H2O、 2.5g 苯酚和 2.5g 无水 亚硫酸钠, 温水浴( 不超过 48℃) 中不断搅拌, 直至溶 液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至 1000mL, 保存 在棕色瓶中。 1.2.1.3 果胶底物(5g/L) 称取 0.5g 果胶, 用 pH4.8 的缓冲液溶解, 充 分 搅 拌 后, 用 缓 冲 液 定 容 至 100mL, 置于冰箱内冷藏(2~5℃)。 1.2.1.4 D- 半乳糖醛酸 (1mg/mL) 称量 1.000g D- 半乳糖醛酸, 用缓冲溶液定容至 1000mL, 获得 1mg/mL 的 D- 半乳糖醛酸溶液。

1.2.2 波长选择和标准曲线的制作 取 9 支 25mL 的 刻度试管编号, 并按表 1 所示加入各种试剂, 在沸水 浴中加热 5min, 冷却后定容至 25mL。1 号试管为标 准空白样, 任选其它一支试管 ( 本实验选择 6 号试 管), 在 450~ 550nm 的范围内每隔 10nm 测定溶液的 吸光度。再以蒸馏水为空白样, 在 450~ 550nm 的范围 内每隔 10nm 测定 1 号试管溶液的吸光度。 根据选择的适波长, 在此波长下以 1 号试管 为标准空白样测定其它试管内溶液的吸光度, 利用 回归分析求得标准曲线方程和相关系数。 1.2.3 DNS 试剂用量的选择 如表 1 所示, 其它试剂 用量不变, 将 DNS 试剂用量设为 3 种处理, 即 1.5、 2.5、 5.0mL, 然后在适波长下测定吸光度值, 通过回 归分析求得标准曲线方程和相关系数。根据相关系 数确定 DNS 试剂的适用量。 1.2.4 酶活力测定 1g 酶在 48℃、 pH4.8 的条件下, 1h 分解果胶产生 1mgD- 半乳糖醛酸为一个酶活力单 位。 1.2.4.1 酶液稀释倍数的确定 如表 4 所示, 每处理 称取 1g( 到 0.1mg) 酶粉( 约 2500U), 用 pH4.8 的 乙酸一乙酸钠缓冲溶液分别稀释到 100、 500、 1000、 2000 倍, 根据酶活力的测定结果确定适的果胶酶 稀释倍数。 1.2.4.2 果胶底物用量的确定 果胶底物的用量如表 5 所示, 分别设置 0.2、 0.5、 0.8、 1.0、 1.5mL, 根据酶活 力的测定结果确定适的果胶用量。 1.2.4.3 酶活力测定步骤 于甲、乙两支 25 mL 比色 管中分别加入一定量的果胶底物, 在 48℃水浴中预 热 5min; 于甲、乙管中分别加 4 mLpH4.8 的乙酸一乙 酸钠缓冲溶液, 甲管中加入 1mL 稀释酶液, 立即摇 匀, 在 48℃水浴中准确反应 30min, 再向乙管中加 1mL 稀释酶液, 并立即放入沸水浴中煮沸 5min, 终止 反应, 冷却; 分别取甲、乙管中的反应液 2mL 于两支 25mL 比色管中, 再分别给甲、乙管加 2mL 蒸馏水, 加 入一定体积 (1.2.2 已确定的适用量)DNS 试剂, 混 合, 沸水浴煮沸 5min, 取出, 立即冷却。加蒸馏水定容 到 25mL; 以标准空白为基准调零, 在适波长处测 定两试管的吸光度(OD 值); 用测得的(OD 甲-OD 乙) 值在标准曲线上查得相应的 D- 半乳糖醛酸的量, 代 入下面公式计算果胶酶活力。 果胶酶活力(U):Y× N× 2/t , 其中 OD 甲- 酶样吸光
度;OD 乙- 酶空白样的吸光度;Y- 酶作用生成的 D- 半 乳糖醛酸(mg);N- 样品稀释倍数;2- 测定酶活力时取 了反应液的 1/2;t- 反应所用时间(h)。 2 结果与分析 2.1 适波长的选择 由图 1 可见, 显色剂-DNS 试剂大吸收波长为 460nm, 当波长超过 460nm 时, DNS 试剂的光吸收急 剧减少; 而标准样的大吸收波长为 500nm, 当波长 超过 500nm 时随波长增加, OD 值降低。此实验一般 加入的 DNS 试剂量应稍微过量, 当波长小于 520nm 时, 过量的 DNS 试剂的光吸收增加。在比色测定中, 一般要求样品大吸收波长与显色剂大吸收波长 之差在 60nm 以上[3]。因此, 本方法中测定样品的波长 应大于或等于 520nm。 选择 520、 530、 540nm 做为测定的波长, 按表 1 的配制方法分别绘制不同波长下的标准曲线, 结果 见表 2。可以看出, 540 nm 的相关系数大, 因此可 选择 540 nm 做为适波长, 在此波长下 DNS 试剂的 吸光度值较小, 接近零, 即使 DNS 试剂过量对样品的 吸光值影响也会较小, 而且标准样的吸光度值高于 0.2, 仍在分光光度计适宜的测量值范围内。
2.2 DNS 试剂用量对标准曲线的影响 DNS 试剂对样品吸光度值的影响较大, 选择适 宜的 DNS 试剂用量尤为重要。由表 3 可知, DNS 试 剂用量为 1.5mL 和 5.0mL 时, 所得的方程相关系数 较 2.5mL 的低。由曲线的斜率可知, 少量的 DNS 试剂 使反应产生的糖不能完全显色, 从而使测量的吸光度 值偏小; 而过量的 DNS 试剂由于在相同的波长条 件下 DNS 试剂的吸收值比标准样品的吸收值高, 从 而导致测量的吸光度值偏大。因此, 适宜的 DNS 试剂 用量为 2.5mL。
2.3 果胶酶稀释倍数对酶活力测定值的影响 固态酶粉活力测定必须进行一定倍数的稀释[4], 稀释酶液和底物的反应产物 D- 半乳糖醛酸与 DNS 试剂显色所得吸光度必须在 2.1 所得的标准曲线范 围内(0.010~ 0.747), 因此, 首先必须进行稀释倍数实 验。稀释倍数及测定结果见表 4。 从表 4 可知, 当稀释倍数为 100 时, 酶样吸光度 为 0.967, 超出了标准曲线的大值 0.747, 而且酶活 力的测定值也明显较低; 当稀释倍数为 1000 时, 酶 样吸光度为 0.509, 在标准曲线吸光度值的范围内; 当稀释倍数达到 2000 时, 酶样吸光度仅为 0.211, 求 得的酶活力与实际值相差甚远。由此可确定稀释倍 数以 1000 为佳。
2.4 果胶用量对酶活力测定值的影响 果胶作为测定中的底物, 是影响测定结果的重 要因素, 果胶在反应中应是过量的, 但严重过量, 这 种胶体就会影响测定的吸光度值[5]。因为果胶中的一 些杂质对酶活力具有抑制作用, 实验中要选择纯度 较高的果胶底物[6]。在确定酶液稀释 1000 倍的条件 下, 对果胶加入量的实验结果见表 5。可以看出, 果胶的加入量对空白样品及样品酶液的测定都有影响, 果胶加入量为 0.5~ 1.0mL 时, 测定结果相对稳定, 加 入量为 1.5mL 时, 反应后的溶液变得混浊, 从而影响 测定结果。为使酶与底物充分作用, 果胶加入量为 1.0mL 时测得的酶活力接近实际值, 所以本实验确 定 1.0mL 作为底物的加入量。 3 结论 通过分光光度法测定果胶酶活力的各影响因素 的实验研究发现, 测量波长、 DNS 试剂用量、果胶酶 稀释倍数以及果胶用量对酶活力测定结果都有较大 的影响。结果认为, 在 48℃、 pH4.8 的条件下, 适宜的 测 定 波 长 为 540nm, DNS 试 剂 (3g/L) 的 用 量 为 2.5mL, 果胶酶的稀释倍数为 1000, 果胶(5g/L) 的用 量为 1.0mL, 以此为参数测得的酶活力较为准确。果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称, 它可分 为内切型和外切型两大类。果胶酶广泛应用于果品的 加工工业中, 主要作用是果品榨汁时降低果浆泥的粘 稠度, 提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和稳定性 等。果胶酶的活力对果品的加工品质影响很大, 因此 测定果胶酶的活力显得尤为重要。测定酶活力的方 法主要有还原法、色原底物法、粘度法等, 其中还原 法中的 3,5 一二硝基水杨酸比色法( 简称 DNS 法) 具 有操作简便, 对试剂、仪器等条件要求不高等优点。 该方法是利用果胶酶在一定温度、时间和条件下水 解果胶, 释放出还原性 D- 半乳糖醛酸, 与 3,5 一二硝 基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 即发生显 色反应。在一定范围内, 水解生成 D- 半乳糖醛酸的 量与吸光度成正比[1~2], 与果胶酶活力成正比, 通过分光光度计测定吸光度, 可以计算出果胶酶的活力。该 方法( 又称分光光度计法) 简单易行, 但操作中影响 因素较多, 往往影响测定结果的准确性。本研究就测 定中各影响因素进行了优化实验, 试图提出果胶酶 活力测定的技术参数。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 乙 酸 钠 (CH3 COONa·3H2O)、 冰 乙 酸 (CH3 COOH)、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠 (C4H4KNaO6·4H2O)、苯酚 以上试剂均为市售分析 纯;3, 5 一二硝基水杨酸 ;D- 半乳糖醛酸 97%, 沃凯化学试剂有限公司; 果 胶、果胶酶 ; 实验用水 均为 去离子水。 ; 电热恒温  1.2 实验方法 1.2.1 试剂配制 1.2.1.1 乙酸一乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8) 首先制备 0.2mol/L 的乙酸溶液和 0.2mol/L 的乙酸钠溶液, 然 后将 0.2mol/L 乙酸溶液 410.0mL 与 0.2mol/L 乙酸 钠溶液 590.0mL 混合均匀, 用酸度计测定。 1.2.1.2 DNS 试剂 (3g/L) 称取 3.00g 3,5 一二硝基水 杨酸, 溶解于 500mL 蒸馏水中, 再逐步加入 10.4g NaOH、 91.0g C4H4KNaO6·4H2O、 2.5g 苯酚和 2.5g 无水 亚硫酸钠, 温水浴( 不超过 48℃) 中不断搅拌, 直至溶 液清澈透明。冷却后用蒸馏水定容至 1000mL, 保存 在棕色瓶中。 1.2.1.3 果胶底物(5g/L) 称取 0.5g 果胶, 用 pH4.8 的缓冲液溶解, 充 分 搅 拌 后, 用 缓 冲 液 定 容 至 100mL, 置于冰箱内冷藏(2~5℃)。 1.2.1.4 D- 半乳糖醛酸 (1mg/mL) 称量 1.000g D- 半乳糖醛酸, 用缓冲溶液定容至 1000mL, 获得 1mg/mL 的 D- 半乳糖醛酸溶液。

1.2.2 波长选择和标准曲线的制作 取 9 支 25mL 的 刻度试管编号, 并按表 1 所示加入各种试剂, 在沸水 浴中加热 5min, 冷却后定容至 25mL。1 号试管为标 准空白样, 任选其它一支试管 ( 本实验选择 6 号试 管), 在 450~ 550nm 的范围内每隔 10nm 测定溶液的 吸光度。再以蒸馏水为空白样, 在 450~ 550nm 的范围 内每隔 10nm 测定 1 号试管溶液的吸光度。 根据选择的适波长, 在此波长下以 1 号试管 为标准空白样测定其它试管内溶液的吸光度, 利用 回归分析求得标准曲线方程和相关系数。 1.2.3 DNS 试剂用量的选择 如表 1 所示, 其它试剂 用量不变, 将 DNS 试剂用量设为 3 种处理, 即 1.5、 2.5、 5.0mL, 然后在适波长下测定吸光度值, 通过回 归分析求得标准曲线方程和相关系数。根据相关系 数确定 DNS 试剂的适用量。 1.2.4 酶活力测定 1g 酶在 48℃、 pH4.8 的条件下, 1h 分解果胶产生 1mgD- 半乳糖醛酸为一个酶活力单 位。 1.2.4.1 酶液稀释倍数的确定 如表 4 所示, 每处理 称取 1g( 到 0.1mg) 酶粉( 约 2500U), 用 pH4.8 的 乙酸一乙酸钠缓冲溶液分别稀释到 100、 500、 1000、 2000 倍, 根据酶活力的测定结果确定适的果胶酶 稀释倍数。 1.2.4.2 果胶底物用量的确定 果胶底物的用量如表 5 所示, 分别设置 0.2、 0.5、 0.8、 1.0、 1.5mL, 根据酶活 力的测定结果确定适的果胶用量。 1.2.4.3 酶活力测定步骤 于甲、乙两支 25 mL 比色 管中分别加入一定量的果胶底物, 在 48℃水浴中预 热 5min; 于甲、乙管中分别加 4 mLpH4.8 的乙酸一乙 酸钠缓冲溶液, 甲管中加入 1mL 稀释酶液, 立即摇 匀, 在 48℃水浴中准确反应 30min, 再向乙管中加 1mL 稀释酶液, 并立即放入沸水浴中煮沸 5min, 终止 反应, 冷却; 分别取甲、乙管中的反应液 2mL 于两支 25mL 比色管中, 再分别给甲、乙管加 2mL 蒸馏水, 加 入一定体积 (1.2.2 已确定的适用量)DNS 试剂, 混 合, 沸水浴煮沸 5min, 取出, 立即冷却。加蒸馏水定容 到 25mL; 以标准空白为基准调零, 在适波长处测 定两试管的吸光度(OD 值); 用测得的(OD 甲-OD 乙) 值在标准曲线上查得相应的 D- 半乳糖醛酸的量, 代 入下面公式计算果胶酶活力。 果胶酶活力(U):Y× N× 2/t , 其中 OD 甲- 酶样吸光
度;OD 乙- 酶空白样的吸光度;Y- 酶作用生成的 D- 半 乳糖醛酸(mg);N- 样品稀释倍数;2- 测定酶活力时取 了反应液的 1/2;t- 反应所用时间(h)。 2 结果与分析 2.1 适波长的选择 由图 1 可见, 显色剂-DNS 试剂大吸收波长为 460nm, 当波长超过 460nm 时, DNS 试剂的光吸收急 剧减少; 而标准样的大吸收波长为 500nm, 当波长 超过 500nm 时随波长增加, OD 值降低。此实验一般 加入的 DNS 试剂量应稍微过量, 当波长小于 520nm 时, 过量的 DNS 试剂的光吸收增加。在比色测定中, 一般要求样品大吸收波长与显色剂大吸收波长 之差在 60nm 以上[3]。因此, 本方法中测定样品的波长 应大于或等于 520nm。 选择 520、 530、 540nm 做为测定的波长, 按表 1 的配制方法分别绘制不同波长下的标准曲线, 结果 见表 2。可以看出, 540 nm 的相关系数大, 因此可 选择 540 nm 做为适波长, 在此波长下 DNS 试剂的 吸光度值较小, 接近零, 即使 DNS 试剂过量对样品的 吸光值影响也会较小, 而且标准样的吸光度值高于 0.2, 仍在分光光度计适宜的测量值范围内。
2.2 DNS 试剂用量对标准曲线的影响 DNS 试剂对样品吸光度值的影响较大, 选择适 宜的 DNS 试剂用量尤为重要。由表 3 可知, DNS 试 剂用量为 1.5mL 和 5.0mL 时, 所得的方程相关系数 较 2.5mL 的低。由曲线的斜率可知, 少量的 DNS 试剂 使反应产生的糖不能完全显色, 从而使测量的吸光度 值偏小; 而过量的 DNS 试剂由于在相同的波长条 件下 DNS 试剂的吸收值比标准样品的吸收值高, 从 而导致测量的吸光度值偏大。因此, 适宜的 DNS 试剂 用量为 2.5mL。
2.3 果胶酶稀释倍数对酶活力测定值的影响 固态酶粉活力测定必须进行一定倍数的稀释[4], 稀释酶液和底物的反应产物 D- 半乳糖醛酸与 DNS 试剂显色所得吸光度必须在 2.1 所得的标准曲线范 围内(0.010~ 0.747), 因此, 首先必须进行稀释倍数实 验。稀释倍数及测定结果见表 4。 从表 4 可知, 当稀释倍数为 100 时, 酶样吸光度 为 0.967, 超出了标准曲线的大值 0.747, 而且酶活 力的测定值也明显较低; 当稀释倍数为 1000 时, 酶 样吸光度为 0.509, 在标准曲线吸光度值的范围内; 当稀释倍数达到 2000 时, 酶样吸光度仅为 0.211, 求 得的酶活力与实际值相差甚远。由此可确定稀释倍 数以 1000 为佳。
2.4 果胶用量对酶活力测定值的影响 果胶作为测定中的底物, 是影响测定结果的重 要因素, 果胶在反应中应是过量的, 但严重过量, 这 种胶体就会影响测定的吸光度值[5]。因为果胶中的一 些杂质对酶活力具有抑制作用, 实验中要选择纯度 较高的果胶底物[6]。在确定酶液稀释 1000 倍的条件 下, 对果胶加入量的实验结果见表 5。可以看出, 果胶的加入量对空白样品及样品酶液的测定都有影响, 果胶加入量为 0.5~ 1.0mL 时, 测定结果相对稳定, 加 入量为 1.5mL 时, 反应后的溶液变得混浊, 从而影响 测定结果。为使酶与底物充分作用, 果胶加入量为 1.0mL 时测得的酶活力接近实际值, 所以本实验确 定 1.0mL 作为底物的加入量。 3 结论 通过分光光度法测定果胶酶活力的各影响因素 的实验研究发现, 测量波长、 DNS 试剂用量、果胶酶 稀释倍数以及果胶用量对酶活力测定结果都有较大 的影响。结果认为, 在 48℃、 pH4.8 的条件下, 适宜的 测 定 波 长 为 540nm, DNS 试 剂 (3g/L) 的 用 量 为 2.5mL, 果胶酶的稀释倍数为 1000, 果胶(5g/L) 的用 量为 1.0mL, 以此为参数测得的酶活力较为准确。

 

 

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