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分光光度计比浊法测定抗菌物质效价
时间:2018-11-19 点击次数:588

琼脂扩散法是测定抗菌物质效价常用的方法,但人为操作因素常常影响实验结果的准确性。实验旨在 建立一种测定准确、操作简单、无需特殊设备的分光光度计比浊法来测定各种抗菌物质的效价。研究发现,以抑 菌率高时对应的培养时间为取样时间点,在中等接种量下,在实验浓度范围内,细菌素 nisin、类细菌素 NFL 和 抗生素硫酸庆大霉素这 3 种抗菌物质的浓度与抑菌率之间的线性关系良好,R2 值均高于 0. 99,标准曲线成立。 该法适用于设备条件简单的实验室准确测定各类抗菌物质效价。

抗菌物质是指具有杀菌或抑菌活性的物质,包括 细菌素、类细菌素和抗生素等生物活性物质。在过去 的 60 多年里,多种能准确测定抗菌物质活性的方法 先后被提出,包括 ATP 生物发光测定法( ATP Bioluminometry) 、绿色荧光蛋白测定法( GFP bioassay) 、 MTT[3-( 4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide]比色法、免疫学方法等 [1 - 4],然而 使用这些方法需要特殊的试剂或仪器设备,因此没有 得到广泛应用。长期以来,琼脂扩散法( agar diffusion assay) 因无需特殊材料,检测成本低[5 - 6]而成为测定 抗菌物质活性常用的方法,但是该法耗时耗力、对 操作人员经验要求高、人为影响因素多,实验者经常 得不到理想的实验结果[7]。1952 年,Berridge 和 Barrett 应用微孔比浊法来测定抗生素效价[8],经过 几十年的不断改进,该法已以成为可以定量测定抗菌 物质的一种方法[9 - 10],但是,需要使用酶标仪这一 “短板”限制了其广泛应用,如能建立起分光光度计 比浊法无疑将极大提高其应用普遍性。为此本研究 对于影响分光光度计比浊法准确定量抗菌物质效价 的关键因素进行了研究,建立了测定细菌素 nisin、类 细菌素 NFL[11]和抗生素硫酸庆大霉素等抗菌物质效 价的分光光度计比浊法。

1 材料与方法

1. 1. 1 菌种 金黄杆菌( Chryseobacterium) NHW 菌株、乳酸乳 球菌( Lactococcus lactis) NFL 菌株和乳酸乳球菌( L. lactis) 8148 菌株,为安徽农业大学食品微生物实验 室保藏。 1. 1. 2 培养基 STAA 培 养 基: 蛋 白 胨 20 g,酵 母 抽 提 物 2 g, K2HPO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,甘油 15 g,琼脂 13 g, 蒸馏水 1 000 mL,pH 7. 0 ± 0. 2,121 ℃下 15 min 灭菌 后冷却至 40 ~ 50 ℃ 左右,加入过滤除菌的链霉素 500 mg,环己六亚胺 50 mg 和乙酸盐 50 mg 混匀,用 于培养金黄杆菌 NHW 菌株。 MRS 培养基: 牛肉浸膏 8. 0 g,Tween-80 1. 0 mL, 葡萄糖 20. 0 g,胰蛋白胨 10. 0 g,酵母抽提物 4. 0 g, K2HPO4 2. 0 g,柠檬酸三铵 2. 0 g,醋酸钠 5. 0 g,MnSO4·H2O 0. 05 g,MgSO4·7H2O 0. 2 g,蒸馏水 1 000 mL,pH 6. 0 ± 0. 2。用于培养乳酸乳球菌 NFL 菌株。 GM17 培养基: 补充了 15 g /L 葡萄糖的 M17 培 养基( 购自青岛海博) ,用于培养乳酸乳球菌 8148 菌 株。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 抗菌物质抗菌类型的确定 乳酸乳球菌 NFL 发酵上清液的制备: 将活化后 的乳酸乳球菌 NFL 菌株以 5% 接种量接种于 MRS 液 体培养基中,30 ℃ 培养 12 h,离心( 10 000 r /min,15 min) 取上清液,将上清液过滤除菌,取滤液备用。 硫酸庆大霉素、氯霉素和类细菌素 NFL 抗菌类 型的确定: 将活化后的指示菌金黄杆菌 NHW 菌株以 5% 接种量接种于 STAA 液体培养基中培养至对数期,离心( 10 000 r /min,5 min) 取菌体,用生理盐水洗 涤 1 次,将菌体重悬于生理盐水中,分别添加终质量 浓度为 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液、888. 89 U / mL 的硫酸庆大霉素水溶液、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌 上清液,30 ℃下振荡 ( 150 r /min) 培养 6 h,分别在 培养的 0 时刻和 6 h 取 200 μL 发酵液涂布于 STAA 平板表面,30 ℃下培养测定菌落总数。 nisin 抗菌类型的确定: 将活化后的指示菌乳酸 乳球菌 8148 菌株以 5% 接种量接种于 GM17 液体培 养基中培养至对数期,离心( 10 000 r /min,5 min) 取 菌体,用生理盐水洗涤 1 次,将菌体重悬于生理盐水 中,添加终浓度为 1. 5 U /mL 的 nisin 盐酸溶液( 0. 02 mol /L) 。30 ℃下静置培养 6 h,分别在培养的 0 h 和 6 h 取 200 μL 发酵液涂布于 GM17 平板表面,30 ℃ 下培养测定菌落总数。 1. 2. 2 不同抗菌物质抑菌率曲线的测定 将活化后的指示菌以 2% 的接种量接种于相应 的培养基中,实验组分别加入终质量浓度为 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液 ( 对照为无水乙醇) 、 888. 89 U /mL 的硫酸庆大霉素水溶液( 对照为无菌 水) 、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株发酵上清液( 对照为 MRS 培养基) 和 0. 5 U /mL 的 nisin 盐酸溶液( 对照为 0. 02 mol /L HCl 溶液) ,培养过程中每隔 2 h 取样,立 即转入冰水浴中以终止微生物生长,于 600 nm 波长 处测定吸光值( 上海奥析,UV1800紫外可见分光光度 计) ,连续测定至 14 h。对照组加入量与实验组体积 相同,其余方法同实验组。 抑菌率/% = ( OD对照 - OD实验) /OD对照 × 100 1. 2. 3 抗菌物质效价分光光度计比浊法的建立 1. 2. 3. 1 指示菌接种量对取样时间点的影响 乳酸乳球菌 8148 接种量对 nisin 效价测定取样 时间点的影响: 将活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株分 别以 2% 、5% 、8% 的接种量接入 GM17 培养基,实验 组中加入终浓度为0. 5 U /mL 的 nisin 盐酸溶液,分别 在 30 ℃下静置培养 1、2、3 h,取样,测定抑菌率和发 酵液浊度增量,浊度增量 OD600 = OD600实验 - OD600起始。 金黄杆菌 NHW 接种量对类细菌素 NFL 效价测 定取样时间点的影响: 将活化后的金黄杆菌 NHW 分 别以 1% 、2% 、3% 的接种量接入 STAA 培养基,实验 组中加入终浓度为 66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株发酵上 清液,分别在 30 ℃下振荡培养 3、4、5 h 取样,测定抑 菌率和发酵液浊度增量 OD600。 1. 2. 3. 2 测定抗菌物质效价标准曲线的建立nisin 效价标准曲线的建立: 将活化后的乳酸乳 球菌 8148 菌株以 5% 的接种量接入 GM17 培养基,实 验组中加入终浓度为 0. 2、0. 5、0. 8、1. 1、1. 4 U /mL 的 nisin 盐酸溶液,在 30 ℃下静置培养 2 h,取样测定 抑菌率。另一实验组中加入终浓度为 0. 4、0. 8、1. 2、 1. 6、2. 0、2. 4 U /mL 的 nisin 盐酸溶液,在 30 ℃ 下静 置培养 5 h,取样测定抑菌率。 2 h 取样的 nisin 效价标准曲线的验证性实验: 将 活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接种量接入 GM17 培养基,实验组中加入终浓度为 0. 4、1. 0 U / mL 的 nisin 盐酸溶液,在 30 ℃ 下静置培养 2 h,取样 测定抑菌率。根据标准曲线的回归方程计算这两个 样品的测定误差率( RSD) 。 RSD/% = 抑菌率( 实际) - 抑菌率( 拟合) 抑菌率( 实际) × 100 类细菌素 NFL 效价标准曲线的建立: 将活化后 的金黄杆菌 NHW 以 2% 的接种量接入 STAA 培养 基,实验组中加入终浓度为 36. 67、43. 33、50. 00、 56. 67、63. 33 μL /mL 的 NFL 菌株发酵上清液,分别 在 30 ℃下振荡培养 4 h,取样测定抑菌率。测定终浓 度为 40、60 μL /mL 的 NFL 菌株发酵上清液的抑菌 率,用所得标准曲线的回归方程计算这两个样品的测 定误差率( RSD) 。 硫酸庆大霉素效价标准曲线的建立: 将活化后的 金黄杆菌 NHW 菌株以 2% 的接种量接入 STAA 培养 基,实验组中加入终浓度为 444. 44、533. 33、622. 22、 711. 10、799. 99、888. 88 U /mL 的硫酸庆大霉素水溶 液,分别在 30 ℃ 下振荡培养 4 h,取样测定抑菌率。 测定终浓度为 577. 77、755. 55 U /mL 的硫酸庆大霉 素水溶液的抑菌率,用所得标准曲线的回归方程计算 这两个样品的测定误差率( RSD) 。 2 结果与分析 2. 1 不同抗菌物质的抑菌率曲线 从图 1 可以看出,随着指示菌在硫酸庆大霉素水 溶液中处理时间的延长,细胞逐步被杀死,失去生长 能力。而指示菌在 nisin、氯霉素和 NFL 菌株发酵上 清液中处理 6 h,活菌数下降幅度均很小,nisin 和氯 霉素是已知的抑菌剂,表明 NFL 菌株发酵上清液具 抑菌活性而非杀菌活性。 在指示菌培养基中分别添加以上各种抗菌剂 后,测定其生长曲线,计算得到抑菌率曲线。从图 2 可见,抑菌类抗菌剂 nisin、氯霉素和 NFL 菌株发酵上

2 抗菌物质效价分光光度计比浊法的建立 2. 1 接种量对取样时间点的影响 抑菌率计算的依据是生物量,而接种量的大小会 直接影响微生物细胞生物量的高低,因此研究了指示 菌接种量对取样时间点的影响。从图 3 可以看 出,中等( 5% ) 和较高( 8% ) 接种量下测定 nisin 浓度 的取样时间点均为 2 h。低接种量( 2% ) 下,指 示菌培养 3 h 的抑菌率高于 2 h 的,导致测定 nisin 浓 度的取样时间点延后。取样时间点的确定 不仅取决于高抑菌率,还要兼顾指示菌生长增量和 培养时间,如图 3 所示,低接种量( 2% ) 下指示菌培 养 3h 的 对 照 组 ( 未 添 加 nisin ) 发酵液浊度增量 ( OD600 ) 很低,表明此时体系中的活菌量较低,不能很 好地表征 nisin 的抑菌效力,且培养时间偏长。因此, 以乳酸乳球菌 8148 为指示菌来测定 nisin 浓度指示菌接种量为 5% ,取样时间点为 2 h。

2. 2 分光光度计比浊法测定抗菌物质效价的标准曲 线的建立 2. 2. 1 测定 nisin 效价标准曲线的建立 以 5% 接种量接种指示菌乳酸乳球菌 8148,在 GM17 培养基中添加不同终浓度的 nisin,培养 2 h,测 定抑菌率,以抑菌率对 nisin 浓度值进行线性回归。 由图 5 可知,在 nisin 终浓度为 0. 2 ~ 1. 4 U /mL,抑菌 率为 25% ~ 98% 的范围内,nisin 浓度与抑菌率之间 呈良好的线性关系( R2 = 0. 9921) ,验证性实验( 表 1) 表明,该方法的准确度较高( RSD < 5% ) 。在非取样时间点测得标准曲线回归方程的 R2 值低于 0. 99,表明此时取样测定所得数据的线性相关度偏
 

2. 2. 2 测定类细菌素 NFL 效价标准曲线的建立 乳酸乳球菌 NFL 菌株发酵上清液中含有类细菌 素 NFL,与 nisin 不同,NFL 菌株发酵上清液不是纯 品,其中还含有未被细胞利用完的营养物质及代谢产 物,实验发现,本比浊法同样适用于发酵液中抑菌物 质活性的定量测定。以 2% 接种量接种指示菌金黄 杆菌 NHW 菌株,在 STAA 培养基中添加不同体积的 NFL 菌株发酵上清液,培养 4 h,测定抑菌率,以抑菌 率对 NFL 菌株发酵上清液添加量进行线性回归。由 图 6 可知,在 NFL 菌株发酵上清液添加量为 36 ~ 64 μL /mL,抑菌率为 7% ~ 58% 的范围内,发酵上清液 添加量与抑菌率之间的线性相关良好( R2 = 0. 994) , 验证性实验( 表 2) 表明该方法的准确度较高( RSD < 5% ) 。

2. 2. 3 测定硫酸庆大霉素效价的标准曲线的建立 由图 7 可知,nisin 测定取样时间点( 2 h) 所 对应的时刻是实验组( 培养基中含 0. 5 U /mL 的 nisin) 生长曲线的对数前期。如前所述,硫酸庆大霉素 的抑菌率曲线与 nisin 等抑菌剂的不同,并没有呈现 明显的峰值,但在 4 h 时抑菌率会处于一直较高的平 台,此时对应的实验组也基本处于对数前期。

3 讨论 采用比浊法测定抗菌物质特别是抗生素效价的 文献不少,方法大致都是将抗菌物质加入指示菌培养 体系中培养一段时间( 一般为 2 ~ 5h) 测定浊度,抗菌 物质浓度的对数与浊度在一定范围内线性关系良好 ( R2 > 0. 99) [12 - 14]。但这些报道中均没有说明抗菌 物质与指示菌培养时间( 即取样测定浊度的时间点) 的确切依据。李秀兰等采用分光度度计比浊法测定 抗菌肽活性,抗菌肽浓度与活力单位之间线性关系良 好,但是操作较为复杂,需要将对数期的指示菌菌体 洗涤后重悬于缓冲液中,加入抗菌肽样品振荡培养 30 min 后测定浊度,将所测结果代入经验公式得到活 力单位[15]。同样,作者也没有说明为何要培养 30 min,这样对于其他种类抗菌物质效价的测定,并不具 有直接的借鉴意义。 本研究所建立的比浊法是将抑菌率与抗菌物质 浓度之间直接建立线性相关,并且找到了抑菌剂和抗 菌剂效价线性定量测定的关键因子,即取样时间点。 以 nisin 和硫酸庆大霉素的效价测定为例( 图 5 和图 9) ,如果取样时间点选择得不好,所得的标准曲线 R2 值就会小于 0. 99,达不到线性相关的要求。无论是 nisin 这种抑菌剂还是硫酸庆大霉素这种杀菌剂,取样时间点对应的都是实验组( 即培养基中加入 抗菌物质) 生长曲线的对数前期( 图 7 和图 8) ,这种 规律性可能是因为本法采用的抑菌率指标依据的是 对照组活细胞与实验组中未被抑制或杀死的活细胞 生长能力的比较,当取样时间点为实验组的对数前 期,实验组生物量基本可以反映当时的活细胞数; 如 果取样时间点为实验组的对数末期,实验组生物量会 包含部分死细胞,就会偏离效价与抑菌率之间的线性 相关了。 除此之外,接种量的大小对抑菌率的高低有显著 的影响( 图 3 和图 4) ,虽然低接种量下高抑菌率值 较高,但取样时间点会延后,且指示菌生长速度 偏低,并不能很好地表现出抑菌物质的作用; 高接种 量从检测时间和高抑菌率方面均较差,因此,接种 量的优化对于提高本方法的应用效果十分必要。 本研究所建立的分光光度计比浊法不仅可用来 准确测定 nisin、类细菌素 NFL 和庆大霉素的效价,而 且具有设备简单、操作简单等优点。有理由相信,本 方法也可以适用于其他抗菌物质效价的测定。首先, 测定抗菌物质抑菌率曲线,以此为依据,抑菌剂以 高抑菌率对应的时间点为取样时间点,杀菌剂可以结 合实验组生长曲线和抑菌率曲线,综合考虑实验组对 数前期和抑菌率峰值选择出合适的取样时间点; 随 后,测定指示菌不同接种量下的抑菌率,确定合适的 指示菌接种量; 后,建立抑菌率与抗菌物质效价之 间的标准曲线。

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