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分光光度计在高中生命科学实验中的应用
时间:2018-11-24 点击次数:607

分光光度计应用于高中生命科学实验, 可以实现从定性到定量实验的转变。 应用分光光度计实验的方法一般为比色法 和分光光度法。 本文以蛋白质含量测定为例介绍比色法, 同时介绍了维生素 C和葡萄糖含量的比色法测定;以叶绿体色素的测定 介绍了分光光度法。 

分光光度计是一种常规的化学分析仪器 , 在高中 生命科学实验中应用分光光度计 , 可以使现有的部分 实现从定性实验向定量实验的转变 ,提升实验的 度和内涵 ,拓宽实验技术在学生课外探究中的应用范 围 。

1 比色法 许多物质本身具有一定的颜色 ,但有些物质本身 无颜色 ,如果加入适当的显色剂就会生成有色物质 。 这些物质的共同特点是 ,显色的深浅与物质浓度成正 比 ,即物质在溶液中浓度越大 , 显示的颜色越深 。因 此 ,常利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液 的浓度 ,这种方法叫做比色分析法 。在现有高中生 命科学实验中 , 常用显色法鉴别营养物质的存在 。应 用比色法可以对这些营养物质进行定量分析 ,并可以 将实验拓展到测定核酸 (DNA、RNA)、胆固醇 、血 糖 、血清中尿素氮的含量 ,以及酶活性等 。

1.1 双缩脲法测定蛋白质含量 蛋白质含有肽键 ,能 发生双缩脲反应 ,形成紫红色络合物 ,颜色深浅与蛋白 质浓度成正比 , 可以用比色分析法来定量测定蛋白质 的含量 [ 1] ,如测定大豆蛋白质的含量 。实验方法 : (1)称取标准 蛋白质 (如结晶 牛血清 白蛋 白 ) 50mg,溶解于蒸馏水 ,并定容至 10mL, 配制成 5mg/mL 浓度的标准蛋白质溶液 。 (2)取大豆 5粒 ,称量结果为 2.48g,浸泡 , 制成匀 浆 ,定容至 250mL,待测 。 (3)取 7支试管并依次编号 , 按照下表在 0 ~ 5号 试管中加入不同量的标准蛋白质溶液和蒸馏水 (制作 标准曲线 ),在 6号试管加入待测大豆溶液 ,并依次向 各试管中加入试剂回归公式 “y=0.0526x+0.0042”即为该标准曲线 的方程 (与解析几何中直线方程类似 ),其中 x为蛋白 质含量 , y为吸光度 。 R平方值表示趋势线的可靠度 , 当 R平方值等于或近似于 1时 , 趋势线可靠 。如果 R平方值较小 ,说明数据点偏离趋势线的比较多 ,需要 进一步分析是不是误差允许的范围 [ 2] ,超出误差范围 的要分析原因并排除之 。 (6)将 6号试管测得的吸光度与标准曲线进行比 较 ,查出对应的蛋白质含量 。或者根据公式也可以求 出蛋白质含量 ,将 y0 =0.159代入 ,得 X0 =2.94。即大 豆溶液中蛋白质浓度为 2.94mg/mL, 样品总蛋白质含 量为 0.735g,约 30%。 1.2 高锰酸钾氧化还原法测定维生素 C的含量 维 生素 C是强还原剂 ,可以将紫色高锰酸钾还原为无色 , 因此 ,高锰酸钾可以被利用来查明食物中维生素 C的 存在 。利用分光光度计测定反应后的溶液的吸光度 , 吸光度与溶液内剩余高锰酸钾的浓度成比例 , 由此可 以间接测出维生素 C的含量 ,如测定橙子的维生素 C 含量 。实验方法 : (1)试剂配制 分别配制 500μg/mL标准维生素 C溶液 (用维生素 C药片配制 )、200μg/mLKMnO4 。 (2)取 50g左右的橙子果肉 ,准确称量 ,记录结果 , 制成匀浆 ,定容至 50mL,待测 。 (3)取 7支试管并依次编号 , 按照下表在 0 ~ 5号 试管中加入标准维生素 C溶液和蒸馏水 , 制成需要的 浓度梯度 (制作标准曲线 )。在 6号试管加入待测样品 溶液 。

(4)从每只试管中取溶液 0.3mL,加入 200μg/mL KMnO4 3.7mL。以 0号试管为空白对照 , 分光光度计 于 565nm波长处调零 , 测定各支试管内样品在 565nm 的吸光度 (A565),重复测 3次 ,记录并计算平均值 。

(5)利用 Excel绘制标准曲线 ,查出待测样品溶液 的浓度 ,再换算出待测的维 C含量 。

1.3 邻甲苯胺法测定葡萄糖的含量 葡萄糖在热的 醋酸溶液中脱水后与邻甲苯胺缩合 ,生成青色的产物 , 产物的量与葡萄糖的含量成正比 , 可以用比色法来测 定葡萄糖的含量 ,如测定苹果的葡萄糖含量 。实验方 法 : (1)试剂配制 先配制 10mg/mL标准葡萄糖原液 (以饱和苯甲酸溶液溶解 ),取 10mL容量瓶 5只 ,分别 编号 1、2、3、4、5,依次加入标准葡萄糖溶液 0.5mL、1. 0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL,再以苯甲酸钠溶液定容至 10mL,混匀 。 1 ~ 5号容量瓶中葡萄糖浓度依次相当于 每 100mL中 含 葡萄 糖 50mg、 100mg、 200mg、 300mg、 400mg。 (2)准确称量 ,取 10g左右苹果果肉 ,制成匀浆 ,定 容至 100mL,待测 。 (3)按照下表实验 ,重复测试 3次 ,绘制标准曲线 , 换算出待测样品的葡萄糖含量 。

2 分光光度法 各种物质的分子结构不同 ,吸收光谱也各不相同 , 可以利用物质的特征吸收峰 ,对该物质进行定量分析 , 而不必将它从混合物中分离 。如果混合液中的不同组 分的光谱吸收峰有明显的差异 ,吸收曲线彼此又有些 重叠 ,可以分别测定混合液在不同组分各自的吸收峰 的吸光度 ,再通过公式计算出各自的含量,叶绿体色 素的定量测定即是如此 。 叶绿素 a、b和类胡萝卜素在 96%乙醇中大吸收 峰的波长分别为 665 nm、649 nm和 470 nm。由文献  得知 ,叶绿体色素在此三个特定波长下的吸光度 (分别 表示为 A664 、A649 、A470 )与叶绿素 a、b和类胡萝卜素的 浓度 (分别表示为 CA、CB、Cc,单位为 mg/L)之间有如 下关系 :CA =13.9665 -6.88A649;CB =24.96A649 -7. 32A665 ;Cc =(1000A470 -2.05CA -114.8CB)/245。根据下式可进一步求出植物组织中叶绿体色素的 含量 :叶绿体色素的含量 (mg/g)=(叶绿素的浓度 × 提取液体积 )/样品鲜重 (或干重 )。 实验方法 :取菠菜 (或其他植物 )叶片 0.2g,共 3 份 ,分别放入研钵中 ,加入少量石英砂和碳酸钙以及 96%乙醇 5mL后研磨成匀浆 , 倒入离心管中 , 用 5mL 96%乙醇分两次冲洗研钵 、研棒 , 3000r/min离心 5min。 将上清夜倒入 25mL棕色容量瓶中 ,用 96%乙醇定容 。 以 96%乙醇为空白 ,在波长 665 nm、649 nm和 470 nm 下测定吸光度 , 分别用 A665 、A649 、A470表示 。 实验结果 见下表 (见下页末 )。 其中 , x表示平均值 , a表示叶绿素 a, b表示叶绿 素 b, c表示类胡萝卜素 。吸光度可以在分光光度计上 直接读出 , 色素浓度 、组织中各色素含量通过计算获 得 。 以上 4个定量实验 ,既可以作为必修实验的拓展 , 又可为学生设计探究课题提供思路 ,比如学生可以利 用分光光度计研究 “市售蛋白粉中蛋白质的含量是否 合格 ”、“探索蔬菜中维生素 C破坏量小的烹调方 式 ”、“市售果汁等饮料中维生素 C含量是否合格 ”、“不良环境对植物叶绿体色素含量的影响 ”等课题 ,提 高探究兴趣 ,增强探究能力 。

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