叶绿素含量的测定

一、前言

叶绿素广泛存在国术等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热比较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀释碱液中可水解成鲜绿色的叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种；叶绿素a和b，两者均易溶于乙醇、yimi、丙酮和lvfang。

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：

1. 原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。
2. 分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯比尔定律计算出提取液中各色素的含量。
3. 叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a、b在652nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a、b的总量。

二、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：水样或植物中提取的叶绿素溶液
2. 仪器设备：电子分析天平；UV1800PC紫外可见分光光度计；漏斗：25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。
3. 试剂：95%乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤

1. 样品的准备

2.测定

取1CM的比色皿，倒入样品，以95%乙醇为空白对照，在UV1800PC紫外可见分光光度计625nm波长下读取吸光度（A）值。

五．计算

将测得的吸光度652nm波长处的吸光度值输入仪器公式，即可求得样品中叶绿素浓度。所得结果再代入公式，即可得出样品叶绿素的含量。

                A652

C（mg.ml-1)=    34.5

式中：C=叶绿素（a和b）的总浓度（mg.ml-1)

A652------  表示在652nm波长下测得样品中叶绿素的吸光度

34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色皿光径为1CM,样品浓度为1g.L-1时的吸光度）。

叶绿素含量（mg.g-1Fw）=C（mg.ml-1)×提取液总量（mL）

                               样品鲜重（g)

方法II

1. 目的

掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。

2.原理

叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a、b的比吸收吸收K为已知，我们即可以根据朗博比尔定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb

A645=16.75Ca+45.6Cb

(1)、（2）式中的A663.A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位为mg,L-1.

82.04、9,27为叶绿素a、b在波长663nm下的比吸收系数。

16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm下的比吸收系数。

解（1）、（2）式联立方程，得：

Ca=12.70   A663-2.69 A645

Cb=22.9 A645-4.68A663

CT-Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度，CT为总叶绿素浓度，单位：（mg,L-1),利用上面（3,4,5）式可以分别计算出叶绿素a、b及总叶绿素浓度。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：菠菜叶、荠菜叶或其他植物叶片
2. 仪器设备：电子分析天平：分光光度计：恒温水浴锅：25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。
3. 试剂：80%乙醇

四实验步骤

1. 叶绿素的提取
2. 从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g（可视样品叶绿素含量高低而增减用量），置于25mL刻度试管中，加80%乙醇10ml左右，加塞放入60-80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12~24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80%乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。
3. 测定
4. 取光径为1CM的比色杯，加入叶绿素提取液距比色皿口1CM处，以80%乙醇作为对照，调到UV1800PC紫外可见分光光度计的多波长测量状态，得出663nm及645nm波长下的吸光度值。

结果计算

将测定得到的吸光度A663、A645值分别代入式中计算出Ca、Cb及CT（即叶绿素a、b及叶绿素总量浓度）。再按下式计算出叶绿素a、b及叶绿素总含量。

叶绿素a含量（mg.g-1Fw)=      Ca×提取液总量（ml)  

                             样品鲜重（g）×1000 

叶绿素b含量（mg,g-1 Fw)=     Cb×提取液总量（ml) 

                                样品鲜重（g)×1000

叶绿素总含量（mg.g-1Fw)=     CT×提取液总量（ml) 

                                样品鲜重（g)×1000

后计算出叶绿素a/叶绿素b的比值，并加以分析。

原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公司计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=acl   式中a比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1CM时，a为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在响应波长下吸光度的综合。这就是吸光度的加和性。此次试验测定叶绿素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的大吸收峰。

二．材料、仪器设备及试剂

• 材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。
• 仪器设备：1.UV1800PC紫外可见分光光度计；2。电子顶载天平（感量0.01g);3.研钵；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量滤纸；7.吸水纸；擦境纸；9滴管。
• 试剂：96%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

三．实验步骤

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉）混匀。2.称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3mL 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3`5min.3.取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，后连同残渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。后用乙醇定容至25mL，摇匀。5.把叶绿体色素提取液倒入光径1CM的比色皿内，以95%乙醇为空白，在UV1800PC紫外可见分光光度计单机模式，多波长测量中得出 波长665nm、649nm下的吸光度值。

实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式中：

Ca=13.9665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665.据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb;mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量；

叶绿素的含量（mg/g)=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数】/样品鲜重（或干重）。