紫外可见分光光度计法、原子吸收分光光度计等法样品前处理方法

当代科学技术的迅速发展，促使分析化学家在不断地研究和改进快速、、灵敏、能适合于各种不同体系的分析方法的技术，特别是像环境、生物等综合复杂的样品体系、由于它们组成复杂，相互之间差别很大，这些样品在自然条件下，受光、热、电磁辐射、微生物等外界条件的作用，会发生诸如氧化、还原、光解、水解、生物降解等一系列变化，故体系不稳定。为此，对这些样品从采样、保存、运输、处理、分析等操作过程中均有一系列特殊要求。这类样品通常需要进行预处理后才能进行（紫外可见分光光度计法、原子吸收分光光度计法）等分析。否则不仅得不到可靠的数据，而且还会污染检测系统，影响仪器性能。所以样品预处理已构成分析化学的重要组成部分。

  一个完整的样品分析过程包括从采样开始到写出报告大致可分为以下五个步骤：1.样品采集；2.样品处理；3.分析测定；4.数据处理；5.报告结果。统计结果表明，上述五个步骤中各步所需的时间相差甚多，通常分析一个样品只需几分钟至几十分钟，而样品处理却要几个小时，甚至几十小时。因而样品前处理方法与技术的研究引起了广大分析化学家的关注。

从环境、生物体中采集的样品一般都不允许未经处理直接进行分析。

样品前处理的目的是：1.浓缩痕量的被测组分，提高方法的灵敏度，降低小检测限；2.消除基体与其他组分对测定的干扰；3.通过愆生化处理，使一些在常用检测器上无响应或低响应值的物质转化为高响应值的愆生物；愆生化还用于改变基体或其他组分的性质，提高它们与被测物的分离度，改进方法的选择性；4.使样品便于保存和运输，如水样通过短的吸附柱，使被测组分吸附，不但缩小样品体积，便于运输，而且使被测组分保存稳定，易于保存；5.除去对分析系统有害（如强酸或强碱性物质、生物大小分子等），以延长仪器的使用寿命。

评价所选择的前处理方法好坏的主要准则是：1.能否大限度地影响测定的干扰物质。2.被测组分的回收率是否高，如果回收率不高，会导致测定结果差，影响方法的灵敏度和精密度。3.操作是否简便，步骤越多越繁琐，不仅浪费时间与精力，而且往往导致样品损失越多，终的误差也越大。4.成本是否低廉，避免使用贵重的仪器和试剂。5.对人体及生态环境是否有不良影响，不用或少用对环境有污染或影响人体健康的药品试剂。

经典的样品前处理方法多达数十种，但用得较多的只有十几种，表8-38列出了这些适用范围。

几种主要的经典样品前处理方法

方法                 原理                          适用范围

物理方法            

吸附                吸附能力强弱不同                气体、液体及可溶的固体

离心                相对分子量或密度不同             不同相态或相对分子质量有差别的物质

透析                渗透压不同                       分子与离子或渗透压不同的物质

蒸馏                沸点或蒸气压的不同               各种液体

过滤                颗粒或分子大小的不同              液固两相分离

液-液萃取           在两种互不相溶液体中分配系数不同     各种在两种液体溶解度差别较大的物质 

冷冻干燥             蒸气压的不同                        在常温下易于失去生物活性的物质

柱层析              溶质与固定相作用力的不同             气体、液体和可溶的固体

索式萃取            不同溶剂中溶解度不同                  从固体、半固体中提取有机物质

真空升华            蒸气压的不同                          从固体中分离可溶物质

超声振荡            不同溶剂中溶度积不同                  从固体中分离可溶物质

化学方法       

愆生              通过化学反应改变溶质性质、提高灵敏度及选择性     能与愆生化试剂作用的化合物

沉淀              不同溶剂中溶度积不同                       与沉淀剂发生反应生成沉淀的物质

络合   使干扰物生成络合物，除去对被测组分测定的干扰    各种与配位体反应的金属离子或其他物质。

对于各种方法与技术，根分析同的和对分析的具体要求，采取不同步骤收集不同成分。如痕量杂质分析应收集杂质，而纯物质的结构测定应收集主要组分等。

• 蒸馏法

蒸馏是用得多，也是广泛使用的样品纯化方法之一。尤其适用于有机化合物，包括在常温下的液体和低熔点的固定，它是根据物质相对挥发度的不同加以分离的。参见第九章第三节。

蒸馏法可分为以下七种。

1. 常压蒸馏   常压蒸馏又分为简单蒸馏与分馏。简单蒸馏又称一步蒸馏。分馏也称分步蒸馏，可看作一系列简单蒸馏组成，因此分馏的效率通常要比一步蒸馏高的多。
2. 减压蒸馏  是在低于大气压下进行的蒸馏与分馏。它特别适用于那些沸点较高或热不稳定的化合物。因为分离度通常随压力降低而增大，所以对一些物质还能提高它们的相对分离度。
3. 蒸汽蒸馏  是用一种惰性气体或与被蒸馏组分互不相溶的蒸汽流过被蒸馏的液体，使其随之汽化，混合成蒸汽流进入冷却系统变成液体。用于产生蒸汽的介质必须是与被蒸馏物质不互溶，相对分子质量小，沸点低，比热容大、不发生反应的惰性物质，而且价廉易得。在符合这些条件的物质中水是理想的、也是常见的物质，尤其适用于大多数有机物，因此蒸汽蒸馏通常也称作水蒸汽蒸馏。

由于产生蒸汽流介质的沸点低于被蒸馏物质的沸点，因此蒸汽蒸馏处理样品时的温度一般低于样品组成的沸点，从而使其具有类似减压蒸馏的优点，主要用于分离热不稳定的有机物。

（4）共沸蒸馏  是通过把一种称为共沸溶剂的物质加到样品中，使它与所需的组分生成共沸物进行蒸馏的过程。由于共沸物的沸点通常低于原始物质，因而蒸馏可以在较低的温度下进行。

   共沸蒸馏中的一个重要问题就是正确选择共沸溶剂。合适的共沸溶剂通常需要符合以下几个条件：1.共沸点要比被蒸馏的组分低10~40℃。2.应与理想状态具有显著的正偏差，以便与被蒸馏成分形成沸点低的低共沸物质。3.在蒸馏与回流温度下应与被蒸馏物质充分互溶。4.经蒸馏后的低共沸物质，很容易除去共沸溶剂，使产物恢复其原始组成。

（5）萃取蒸馏   是一种萃取与蒸馏结合的过程。萃取蒸馏需要在蒸馏原液中加入一种沸点比蒸馏原液高的物质-萃取剂，生成的萃取物往往在装置的底部。萃取蒸馏过程中，蒸馏原液中各组分的分子受热逸出，自下而上进入蒸馏柱，而萃取剂自蒸馏柱顶部加入，逆流而下，他们与原液中各组分的分子连续接触，进行有选择地萃取，根据分子类型不同，把所需的组分从蒸馏物中分离出来。

（6）固相蒸馏  又称升华，是指由固体直接转化为气体而不出现液体的过程。这种过程必须在低于该物质三相点的条件下进行。从而提高固体物质的蒸发速率。加热是提高生化速度的另一途径，但温度一般低于该物质的熔点以下30℃。因此，升华技术特别适用于制备与分离那些受热易分解或必须在较低温度下处理的物质。

（7）萃取升华  是在升华过程中通入惰性气体，使被升华物质的分子随惰性气体分子一起逸出，然后冷却为固体。这种方式，与水蒸汽蒸馏相似。

色谱法（薄层析和柱层析）

色谱法是样品制备与前处理中常用方法之一，有关各种色谱法原理、装置、操作方法与应用等参见十九章、第二十章及第二十一章。

根据流动相的不同，色谱法可以分为气相色谱仪、液相色谱和介于两者之间的超临界流体色谱。

常用的展开方式以前沿展开与洗脱展开为主，而置换展开较少采用。前沿展开可用于浓缩被测的微量组分，也可用于除去微量组分。洗脱展开主要用于选择性分离某一种或几种所需的组分。需要注意的是柱色谱用于样品处理时，通常色谱柱的负荷超过它的线性容量范围，它是处于非线性色谱的工作状态，因而对操作参数的选择应与通常做定量分析时的考虑有所不同。

样品前处理中的色谱固定相填料在气相色谱中以吸附剂为主，在液相色谱中除吸附剂外还有还有化学键合填料，通常为正构烷基C8、C18等、离子交换剂、疏水作用填料、亲和作用填料等。与近代液相色谱填料不同的是这类填料一般颗粒较大、分布较宽，通常在低压下使用，因而仍属低压色谱或经典色谱仪的范畴。色谱柱通常是几厘米至几十厘米长的玻璃管或聚乙烯、聚丙烯塑料管。固定相颗粒用常规重力振荡填充，不需液相色谱均浆裝柱设备，样品从柱顶部加入，靠流动相的重力进行展开，或在柱出口端接负压，加快展开速度。

常用的主要固定相填料，如氧化铝、硅胶、硅藻土、活性炭、分子筛、离子交换剂等的使用、活化及其他注意事项，参见第十九章节。化学键合固定相参见第二十一章第三节。

气相色谱法用于样品制备与前处理的对象主要是气体样品，而且常用前沿展开技术，让样品本身作为流动相通过填充了吸附剂的色谱柱，使样品中痕量组分（杂质）吸附在填料上，再用溶剂洗脱吸附的痕量组分（杂质）进行分析。此法在超纯气体中杂质的分析及环境大气质量的评价中得到广泛应用。

使用前沿展开法时必须注意被分离组分在填料上的柱容量，它不仅与被分离组分的色谱行为有关，而且也随样品中其他组分的多少及他们的色谱行为而变化。不掌握这些性质就无法大限度地利用柱填料的分离能力，取得好的处理效果。

柱色谱法处理样品时，由于固定相颗粒来源不同，批号不同，同类填料的理化性能会有大的差异，加上活化方法不同，填充方式又因人而异，所以样品制备与前处理结果的重现性与可比性均较差。目前已有商品柱供处理样品用，因而发展成一种专门的样品前处理方法，即固相萃取法。

   共沉淀法

在痕量组分和常量组分的溶液中，当常量组成形成沉淀时，通常还未达到溶度积的痕量组分也随之析出沉淀的现象。这时由常量组分形成的沉淀称为载体，载体可以是原来试样中的基体成分，也可以是外加的特定物质，需根据共沉淀的要求选择。生物材料痕量分析中常从两方面利用共沉淀；使待测成分从溶液中析出，或使特定干扰从溶液中除去。前者也起富集作用，应用较广。

共沉淀的体系和作用特点

1. 共沉淀体系  约有70多种金属离子可用不同的载体共沉淀，它们常用于生物体液中痕量成分的富集和分离。

 常见的无机共沉淀剂有：

PH 3~8时生成的氢氧化锌可分离As（III，V）、AI（III）、Nb（V)、 Ta(V） 、W（VI）。

在硝酸介质中由高锰酸钾（盐）和硝酸锰溶液加热生成的二氧化锰，可使Sb（III）、Bi(III)、 Sn（IV)、 Pb(II)、 TI（III）、 Au（III）共沉淀。

 在PH3.2~9.5生成的氢氧化铁，可载带多种阴、阳离子如AI（III)、Cr(III)、 Ti(III,IV)、 Hf(IV)、 U（IV）、 As(V）、 Mo（V）、 Se(IV,VI)等共沉淀析出。

铁、锌、镉的硫化物在微酸性或中性介质中，可将Hg、 Cu、 Ga、 In等很好载带。

常用的有机共沉淀剂可分为两类：一类是过量试剂作为本身参与组成目标组分的络合物载体；另一类是试剂仅作为载体而不参与络合物的形成。通常以前者较多，又可分为简单螯合物体系如8-羟基喹啉的载带各种金属离子的相应螯合物，以及离子型络合物和其他三元或多元络合物体系，如海水中10-9级的银、钴、钼等可被8-羟基喹啉和二乙氨基二硫代甲酸盐及酚酞等形成螯合物阳离子与有机阴离子的多元螯合-缔合体系共沉淀。

（2）共沉淀作用的特点  它的一个显著特点是不要求制备纯的沉淀物或沉淀*，而只期望能充分富集痕量组分。在操作上共沉淀时并不需要将沉淀与溶液定量分离，可在沉淀沉降后倾泻滗出上层泽液，简化了通常过滤繁琐步骤。还有另一优点，可以在沉淀后去除沉淀剂。如许多有机共沉淀剂在富集了痕量成分后，可用灼烧或溶解除去，从而进一步消除了基体干扰，改善富集效果。

2.共沉淀的分类和作用机理

共沉淀按其对组分的化学作用可为混晶、吸附和共结晶等几类。

1. 混晶 指痕量成分（或杂质）分布在常量物质或基体沉淀的晶体内部。如，在含痕量Pb2+的试样液中，加入Ba(NO3)2,然后加过量沉淀剂硫酸，Pb2+就能与载体BaSO4生成混晶Ba(Pb)SO4从溶液中析出，形成混晶共沉淀。若两种盐（基体沉淀和待分离成分）属相同的晶系，离子电荷相同，并且离子大小相差不超过10%~15%时，则沉淀中的一种离子可被外来离子取代，也就是形成固体溶液或称固体溶体。这过程分均匀掺杂和掺差掺杂两种情况，前者指沉淀迅速重结晶，后者指固体不进行重结晶，缓慢增大。
2. 吸附 指痕量成分分布于常量物质沉淀颗粒的表面，如氢氧化铝的胶体沉淀以其巨大表面吸附杂质。

   吸附与胶体的应用关系密切。胶体通常指直径10-7~10-4cm范围内的颗粒，估计每个这样的颗粒含10²~10 4cm 范围内的颗粒，估计每个这样的电解质的絮凝作用很敏感，且凝聚过程不可逆，既不会在稀释时再分散，他们又称溶胶，如碘化银、硫化砷等，黏度低；后者则称为乳胶，蛋白质和淀粉是其典型物，粘性强，对电解物的凝聚作用不敏感，又称亲液胶体。在生物试样制备和处理中，后一类更为重要。但在杂质分离中，前者很实用。

在胶粒聚沉形成胶团时，痕量组分包在胶团中，称作包藏。通常认为胶体沉淀的吸附基本上是物理作用，不要求共沉淀组分与沉淀基体结构相匹配，因而选择欠佳，多种杂质均能被载带，其性质相差甚远的成分亦能被吸附，例如氢氧化铁吸附尿液中的痕量碘（I)、氢氧化锌吸附尿液及某些废液中十多种杂质，并非由于化学性质相似。

（3）共结晶   与混晶共沉淀相似但实质有异。这是利用沸点较低的水溶性有机溶剂预先溶解某些有机螯合剂，然后加入试样溶液，使待测成分形成络合物晶体。通常这类络合物的晶形与试剂的晶形相似，当加热使有机溶剂蒸发时，原来的螯合剂晶体将析出，并把痕量成分的络合物载带下来，这就是共结晶的实质。

四．重结晶

重结晶是一种从溶液中析出固体的过程。一般在低温下进行，特别适用于热敏化合物的分离与纯化，蒸汽压接近的物质，以及光学非对映异构体的分离。还用于浓缩溶液，避免挥发性成分的损失，减少对容器的污染。它的应用对象极广，参见第九章节。

1. 重结晶步骤  首先把不纯物溶解在合适的溶剂中，溶解时的温度根据溶质的性质而定。对于溶解度随温度升高的物质，一般在接近溶剂沸点的温度下进行溶解，并不断震荡使溶液接近饱和状态，然后趁热迅速过滤，除去不溶的固体微粒。为防止过滤过程中由于冷却析出晶体，可以使用加热漏斗。再把过滤后的溶液冷却，使溶质晶体析出，析出的晶体可用离心分离或过滤，与母液分离，通过离心分离比过滤更具有优越性，特别是分离细微晶体，不仅效率高，操作方便，而且比过滤速度快的多。后用少量新鲜的冷溶剂洗涤分离后的晶体，不仅效率高，操作方便，而且比过滤速度快得多。后用少量新鲜的冷溶剂洗涤分离后的晶体，除去晶体表面的母液并加以干燥。
2. 重结晶过程中溶剂的选择   合适的溶剂必须符合以下几个条件：1.重结晶的物质在高温和低温下的饱和溶解度有明显的差别，差别越大，收率越高；2.易使重结晶的物质形成晶体；3.溶剂本身容易从晶体中除去；4.与晶体不发生化学反应；5.易挥发而不可燃。此外相似的规则、理化性质、同系物的碳数规则等对溶剂选择也有指导意义。若单一溶剂不适合时，可选用混合溶剂。

用混合溶剂重结晶时先将溶质溶于易溶溶剂中，若加温有利于溶解可以加热，再加入热的第二溶剂，直至溶液浑浊或析出晶体。再加几滴种溶剂使溶液变清，趁热过滤后马上冷却，让晶体析出。这里需要强调的是混合溶剂只是在没有合适的单一溶剂时不考虑使用混合溶剂。

静态吸附法

这里指固、液两相，特别是作为吸附剂的固相处于相对静止状态的一类吸附方法，可粗分为筒单物理-化学吸附、离子交换和络合作用三类。

1. 简单物理-化学吸附

常用的固定相有活性炭、硅胶、氧化铝、白土、分子筛、纤维素等，广泛地用于生物材料痕量分析。它们的特点是其表面未经化学改性，吸附机制属一般物理化学作用。

1. 活性炭  为非极性吸附剂，较易吸附极性极小的分子。通常可用于脱色，例如吸附菜蔬果汁中的色素，亦可用于去味和去气体，对NO3-、NO2-也有相当吸附能力。主要有骨炭和木炭两类。骨炭是用兽骨经脱脂及热处理制成，主要成分为磷酸钙。木炭由锯木、煤粉、糖、海草等含炭植物与硅藻土或浮石，以及其他不溶盐类混合加热后，有机物分解而将炭沉积于多孔的无机物上面而得，其中木炭较常用。商品活性炭的比表面约为100~1000㎡/g，用前需经分筛，其粒度小于90um的约占92%，表面积约为800㎡/g，此种活性炭50mg足以富集100ug痕量成分。
2. 硅胶  由硅酸的胶状沉淀部分脱水时形成的一种多孔性物质。其吸附性由于其表面含有硅醇基Si-OH,可与极性化合物或其他适宜的不饱和化合物形成氢键，故对极性物如水强烈吸附，是优良去水剂，广泛用于油脂分析及石油组分分析。硅酸呈酸性PKA1，10；PKA2，12。
3. 氧化铝  氧化铝活性在于表面吸附表层水形成铝羟基AI-OH，具有形成氢键的能力，一般略带碱性。常用于脱色或使蛋白质聚沉，或使胶态物凝聚，适用于碱性和中性介质，并可活化反复再用。
4. 白土 又称漂白土，主要用于除去动、植物油中的恶臭、异味及颜色，其主要成分是氧化硅和氧化铝，因而具有两者的特点。天然白土组成相当于5SIO2。AL2O3，约含有50%~60%的水分，孔隙率达60%~70%，比表面120~140㎡/g，能吸附自重12%~15%的有机物质。生物材料分析中用于漂白，使动、植物体液及浆汁中的蛋白质聚沉。白土浸于水中时，PH为6.5~7.5.
5. 分子筛   又名沸石，是一种金属硅铝酸盐晶态矿物质，其晶体结构基本上是由SiO4和ALO4四面体的三维骨架构成的。含铝的四面体为负电性，晶体中包含的金属阳离子平衡该负电。当沸石脱水时，其晶体呈蜂窝结构，但四面体骨架不变，且其中的空穴呈规则排列，空穴间有分子大小的孔道交联。