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紫外分光光度计UV1901PC上海奥析科学仪器有限公司测酶
时间:2016-09-18 点击次数:814

 

紫外分光光度计UV1901PC上海奥析科学仪器有限公司测酶激肽释放酶原激活剂测定法

本法系采用显色底物法(或显色基质法)测定供试品中激

肽释放酶原激活剂(P KA )含量。

试剂 1) 0. 0 5m o l/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-

HC1)缓冲液(0. 15mol/L氯化钠溶液,简称TNB) 称取

6 .06g三羟甲基氨基甲烷(T ris,分子量为121.14)8. 77g

氯化钠,加适量水溶解后,用lm o l/L盐酸调p H 值至8 .0

补加水至1000mlD

(2)2m m ol/L激肽释放酶显色底物(S~2302)溶液称取

S-2302 12. 5mg, 10ml 水溶解。

(3 )前激肽释放酶(P K ) 采用适宜方法提纯P K , 小体

积分装,_3(TC以下保存备用。

PKA标准品溶液的制备取P K A 标准品适量,用

0. 85%氣化钠溶液分别稀释成每lm l中含10. OIU. 20. 0 IU

30.0IU40.0IU5 0 .0 IU的溶液。按每次用量,小体积分

装,一3 0 t;保存备用。用前融化(仅允许冻融1 次),并用

TN B稀释10倍。

供试品溶液的制备取供试品适量,用T N B 稀释

10倍。

测定法取供试品溶液20^1,加至9 6孔微量滴定板孔

内,加PK 20.50^1,同时开动秒表计时,向每孔加P K

时间间隔应相同,将微孔滴定板振荡1分钟;加盖,于25.

30t;放置30分钟后,按加P K 的顺序和时间间隔向各反应

孔加2mmol/L S-2302溶液2 0 j J ,振荡1 分钟;加盖,于

25.30aC放置1 5分钟后,再以同样的加液顺序和时间间隔

50%醋酸溶液2 0 f J ,振荡1 分钟后,照紫外-可见分光光

度法(通则0401),在波长405nm处测定吸光度;同时以

TNB20.50F1代替PK 20.501,同法操作,作为空白对

照,用P K A 标准品溶液的2 (^1替代供试品溶液,同法操

作。以P K A 标准品溶液的P K A活性的对数对其相应的吸

光度对数作直线回归,求得直线回归方程,计算出供试品

P K A 活性。

【附注】(1 )每个P K A标准品溶液和供试品溶液做3孔,

其中2 个为测定孔、1 个为对照孔,2 个测定孔吸光度差值

应小于0. 020

(2 )每次测定可根据供试品P K A含量,适当调整PKA

标准品溶液的范围。

(3 )线性回归的相关系数应不低于0. 99

(4 )PK、士230250%醋酸溶液时,各孔的间隔时

间应相同,加液的顺序要一致,尽可能使各孔处于同一反应

条件下。

(5 )P K和加S~2302溶液后的放置时间系从*孔加

液时算起。

(6 )如放置温度低于251C, 应分别在两次反应过程的限

定时间内于3 7 t:放置10分钟。

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