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紫外可见分光光度计测酶活性原理及过程
时间:2017-04-19 点击次数:2500

 

紫外可见分光光度计测酶活性原理及过程

紫外可见分光光度计是利用物质对光的选择性吸收或发射的现象,通过测量不同波长的光能 量变化(当入射光强度一定时,介质的吸光度于介质中吸光物质和介质浓度的乘积成正比) 而对物质进行定性和定量分析的仪器。被广泛用于水质,大气,降雨,土壤,工业生产,药

品检验,污水检验,香料,医药,疾控,人体化指标分析,化妆品,金属元素,无机盐,海

洋地质勘察,水厂,污水处理,农药残留,作物成分,化肥检测,土壤成分,植物保护,植

物检疫,饲料检测,动物疾病预防,防腐剂等。

在食品行业中酶制剂是很好的保鲜添加剂,需要通过加热等方法消除其不利影响。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一,这次实验仪器使用的是UV1901PC双光束紫外可见分光光度计,产地上海,品牌奥析,生产厂家为光源灯使用全进口光源,氘灯为滨松无臭氧环保型氘灯,可以减少操作者对臭氧的吸入(长期吸入臭氧对人体有害),钨灯为德国欧士朗钨灯,检测器为美国派来兹,并且使用加厚光学底板,更加保证了仪器的稳定性。

仪器的光度系统分成两条光路,一条测试光路,一条参比光路。在参比窗口上放置一参照物;测试窗口则先后放置参比标准和待测样品。

参比光路和参照物的作用是,监测参比标准和待测样品测量过程中光源能量波动和电气部分的漂移,计算机将两次测量中的变化情况逐个记录,在zui后计算时予以校正,因此双光束紫外可见分光光度计的读数值的准确性更高。

操作步骤

25 4.5ml 50mmol/L pH8.3K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液,再加入 10ul 50mmol/L的连苯三酚,迅速摇匀,倒人光径lcm 的比色杯,在UV1901PC双光束紫外可见分光光度计325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定SOD标准品,对所测样品SOD活性进行校正。在lml反应液中,每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位, 325nm 0.035OD/min为一个酶活单位,此种方法测超氧化物歧化酶。

0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min,用2mL 20%TCA终止反应,于波长450nm处用UV1901PC双光束紫外可见分光光度计测定吸收值。上述条件下,将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位,此种方法测多酚氧化酶

向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制,调节pH 10.0),于55℃水浴下保温5 min,然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min,加入DNS试剂1.5 mL,混匀,在沸水中加热10min,立即用自来水冷却,再加入21.5 mL蒸馏水,混匀,于UV1901PC双光束紫外可见分光光度计520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。在上述试验条件下,以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位,此种方法测果胶酶。

用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管,并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min,冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用UV1901PC双光束紫外可见分光光度计540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。植酸酶以植酸钠为底物,采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠(酶作用底物,用0.25 mol/lpH5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml37 oC预热5 min后,准确加入适当稀释的酶液0.5 ml(对照组先加反应终止液),37 oC水浴反应30min后,再加入4 ml反应终止液(现用现配)冷却至室温,在415 nm处测定OD值,利用无机磷标准曲线计算出酶活。在37℃,每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中(用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位,此种方法测胰α-淀粉酶

0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液 ,于50℃水浴中保温30min,加2.0 mL质量分数为10%NaOH溶液终止反应,再加入2.5mLDNS试剂,于沸水浴中煮沸15min,冷却,在UV1901PC双光束紫外可见分光光度计550 nm波长处比色,要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照,对照管先加入0.5mL酶液,然后加入2. 0 mL质量分数为10%NaOH溶液将酶灭活,再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL,与待测管一起保温,加入DNS,煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。在上述条件下,每30min产生0.5mg还原糖为1Cx活力单位,即每1 h产生1.0mg还原糖为1Cx活力单位,此种方法测羧甲基纤维素酶。

  以木聚糖为底物,用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml,加 1%木聚糖液0.9ml,置50℃水浴保温30min后,加DNS 2ml于沸水浴中显色3min,用自来水冷却后,加蒸馏水定容25ml,测O.D值,此种方法测木聚糖酶。每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。

中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪素底物产生含有酚基的氨基 酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正 比。通过在660 nm测定其吸光度,可得到酶解产生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力, 以此代表蛋白酶的总酶活力。取3支试管(一支空白管,两支样品管),分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL,将3支试管放入40℃水浴中预热5 min,同时将测定底物(1%酪素)置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时,反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L三乙酸2 mL1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管,分别吸取上述相应滤出液1.0 mL0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀,置40℃水浴中放置20 min(显色),取出,迅速冷却置室温。,在紫外可见分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。

 α-淀粉酶在10 mL 试管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL pH 4. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 5 mL 40 ℃预热10 min。然后加入多倍稀释的0. 5 mL 酶液, 40 ℃保温5 min后,加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 终止反应。再取2 mL 反应液与0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL显色,测定OD620。与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后,计算酶活力。在pH 4. 2、温度40 ℃下, 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量为一个酶活力单位

 

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