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紫外分光光度法测定黄瓜籽中总多糖、 总黄酮、总皂苷的含量
点击次数:522 发布时间:2018-10-12

黄瓜籽为葫芦科植物黄瓜 Cucumber sativus L.的干燥 成熟种子。《中华本草》中记载其具有续筋接骨、祛风、消 痰的功效,主治骨折筋伤、风湿痹痛、老年痰喘[1]。黄瓜籽 中富含有多种氨基酸、活性肽、蛋白质等物质,能维持人体 的骨代谢,调节钙、磷代谢和骨容量,还具有聚集骨生长因 子及诱导骨生长因子分泌的作用。黄瓜籽中含有多种营养成 分,其中包含大量人体必需的脂肪酸、植物甾醇、糖和苷类、 挥发油以及多种无机盐等 [2,3],但其所含总多糖、总皂苷及总 黄酮的含量尚未见报道。本研究采用紫外分光光度法对黄瓜 籽中以上三类物质的含量进行分析,为下一步药理实验提供 依据。为葫芦科甜瓜属植物黄瓜 (Cucumis sativ us L.) 的干燥成熟种子,使用前烘干并粉碎成粗粉。 葡萄糖对照品,批号 110833- 200503;牛血清白蛋白对照品, 批号 140619-200919;芦丁对照品,批号 100080-201408;薯 蓣皂苷元对照品,批号 111539-200001;以上对照品均购自于 中国药品生物制品检定所。蒽酮、浓硫酸、乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚等均为分析纯,D101 大孔吸附树脂(天 津市汇达化工)、考马斯亮蓝(天津科密欧试剂)等。 2 方法与结果 2.1 黄瓜籽多糖的提取与含量测定 2.1.1 多糖的提取 [4] 称取黄瓜籽粗粉 100g,加 5 倍量 90% 乙醇加热回流提取 3 次,每次 2 h,过滤,合并滤液, 滤液回收乙醇。滤渣挥干乙醇,加水煎煮 3 次,每次 2 h,合 并滤液,加热浓缩至 60 ml,加 95% 乙醇调至溶液的乙醇浓度 为 80%,Sevage 法除蛋白后,于 4℃ 静置过夜,抽滤,沉淀 依次以无水乙醇、丙酮洗涤,并于 60 ℃ 烘干,得到粗多糖 提取物。 2.1.2 黄瓜籽多糖的含量测定 2.1.2.1 标准曲线的制备 [5] 精密称取 105℃干燥至恒重 的无水葡萄糖对照品约 10mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸馏表 1 胆酸线性范围测定结果 浓度(mg/ml) 0.00677 0.0135 0.0203 0.0270 0.0338 吸收度 0.1430 0.2768 0.3915 0.5389 0.6732 线性方程为:y=0.00793+19.53x 相关系数 r=0.9994,测 定结果表明胆酸在 0.00677~0.6732mg/ml 浓度范围内与吸收 度有良好线性关系。 4.3 讨论 通过对牛黄清感胶囊的薄层色谱分析,可以很好地鉴别 人工牛黄。结果斑点清晰,阴性无干扰,专属性强;利用工 作曲线法测定处方中人工牛黄的胆酸含量,为牛黄清感胶囊 质量的定量控制奠定了基础。

水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得 0.10 g /L 的葡萄糖对照 品溶液。再取上述对照溶液适量分别加水配成 0,0.02,0.03, 0.04,0.06,0.08,0.10g/L 的 溶 液,分别吸取不同浓度溶 液1ml置 10 ml具塞试管中,每管各加入0.2% 蒽酮 - 硫 酸溶液 4 ml,待各管加完后同时摇匀,置于沸水中加热 15min,取出后迅速置于冷水中冷却至室温,放置10min, 于 627nm 处测定吸光度,以葡萄糖浓度C为横坐标,吸光 度 A 为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程 Y=0.0072X+0.0044 (R2=0.9992),表明样品在 0.00 ~ 0.10g/L 范围内线性关系 良好。 2.1.2.2 黄瓜籽多糖的含量测定 精密称取干燥至恒重的黄 瓜籽粗多糖样品 10mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸馏水溶解 并稀释至刻度,摇匀,得浓度为 0.1 g/L的黄瓜籽粗多糖溶液。 精密吸取黄瓜籽粗多糖溶液 1.0 ml,按 2.1.2.1 项下方法测 定吸光度,由回归方程计算样品中总多糖含量。 2.1.3 结果 2.1.3.1 Sevage 法除蛋白结果 粗多糖样品经Sevage 法 多次除蛋白,以牛血清白蛋白为对照品,通过考马斯亮蓝法 (UV,595nm) 测定残留蛋白的含量,结果见表 1。 样品处理 标准曲线方程 蛋白含量 % 除蛋白前 Y=0.0083X+0.0502 
(R2=0.9996)
33.18 第三次除蛋白 14.87 第五次除蛋白 14.51 第六次除蛋白 14.41 由表 1 可见,第五次、第六次除蛋白后样品中残留蛋白 含量分别为 14.51% 和 14.41%,含量变化不大,因此不再继续 除蛋白。 2.1.3.2 粗多糖提取物性状、提取率及含量 黄瓜籽粗多糖 提取物为白色粉末状,得率为 4.59%。粗多糖提取物中多糖含 量为 23%,占生黄瓜籽的 1.06%。 2.2 黄瓜籽总黄酮含量测定 2.2.1 总黄酮提取物的制备 [6] 称取黄瓜籽粗粉 500g,加 4 倍量石油醚于 50℃ 水浴中加热回流提取 3 次,每次 2 h, 滤过,合并滤液,回收石油醚除去脂肪油部分,药渣置通风 处放置挥干石油醚,加入 3 倍量 75% 乙醇溶液,加热回流提 取 3 次,每次 2 h,滤过,合并滤液,减压浓缩,将浓缩液 均分成两份,冷藏一份备用。另一份加 100ml 蒸馏水混匀, 经大孔吸附树脂 D101(已经预处理)分离纯化,先用 3BV 蒸 馏水静止吸附 24h,再依次加入 2BV 的 20% 乙醇洗脱、2BV 的 50% 乙醇洗脱、4BV 的 75% 乙醇进行洗脱,合并洗脱液,回收 乙醇 , 干燥即得总黄酮粗提物。 2.2.2 总黄酮的含量测定 2.2.2.1 标准曲线的绘制 [7] 精密称取芦丁对照品 0.1260g 置于 10ml 容量瓶中,加70%乙醇溶液使之溶解并定容至刻 度,摇匀,即得芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml,分别置于 10ml 容量瓶中,加 0.05g/ml 亚硝酸钠溶液 0.3ml,摇匀后放置 6min,加 0.1g/ml 硝酸铝 溶液 0.3ml,摇匀后放置 6min,加 1.0mol/L 氢氧化钠溶液 4.0mL,再用 70% 乙醇溶液定容至刻度,摇匀,放置 15min。 于 510nm 测定吸光度值,得到回归方程为 Y=0.0115X-0.0094 (R2=0.9990),表明样品在 0.00 ~ 0.756 g/L 范围内线性关 系良好。 2.2.2.2 总黄酮的含量测定 精密称取 2.2.1 处理好的总黄 酮样品 0.5213g 于 10ml 容量瓶中,加 70% 乙醇溶解并定容至 刻度,摇匀,再准确吸取 1ml 溶液于 10ml 容量瓶中,按照标 准溶液制备方法进行实验并测定吸光度。 2.2.3 结果 经上述制备方法得到的总黄酮样品为1.0665g,得率为 0.43%。根据回归方程计算提取物中总黄酮含量为 67.98%,占生药量的 0.29%。 2.3 黄瓜籽总皂苷的提取分离及含量测定 2.3.1 总皂苷的提取分离[8] 取 2.2.1 中冷藏储备样品 17.97g加5倍体积的蒸馏水溶解,用乙酸乙酯萃取两次,每 次 90ml,水层再用水饱和正丁醇萃取三次,每次 90ml,合并 正丁醇层,回收正丁醇,干燥即得黄瓜籽总皂苷提取物。 2.3.2 总皂苷的含量测定 2.3.2.1 标准曲线的绘制 [9] 精密称定薯蓣皂苷元对照品约 3mg, 置于 10ml 容量瓶中 , 加甲醇溶解并定容,得到对照品 溶液。精密吸取对照品溶液 0,0.3,0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml 分别置于 10ml 容量瓶 , 挥干溶剂 , 加高氯酸至刻度,摇匀, 65℃水浴加热显色 15 min,取出后立即置于冰水浴中 15min 后停止反应,于 410 nm 波长处测定吸光度值。计算得回归方 程为 Y = 8.348X+ 0.078(R2= 0.997),结果表明薯蓣皂苷 元在 0.0 ~ 0.3 g /L 范围内与吸光度呈良好的线性关系。 2.3.2.2 样品总皂苷的含量测定 称取2.3.1 中得到的总 皂苷提取物0.3456g 于 10 ml 容量瓶中,加甲醇溶解并定 容,准确吸取 1ml 于 10ml 容量瓶中,同法制成样品溶液并于 410nm 波长处测定吸光度。 2.3.3 结果 上述制备方法得到黄瓜籽总皂苷1.45g,提 取率为 0.58%,根据回归方程计算得提取物中总皂苷含量为 30.22%,占生药量的 0.18%。 3 讨论 总多糖提取物中 , 常伴有无机盐、蛋白质、色素及醇不 溶性小分子有机物 ( 如低聚糖 ) 等杂质 , Sevage 法是常用的 除蛋白方法。本研究经 6 次除蛋白后,残留蛋白含量相对稳 定,可能是糖与蛋白形成糖蛋白复合物 , 使蛋白质的脱除更 加困难。黄瓜籽经提取分离得到的提取物中总黄酮含量达到 67.98%,说明此方法应用于黄瓜籽总黄酮的分离纯化良好; 另一提取物中总皂苷含量为 30.22%,由于方法中采用溶剂萃 取法进行分离达不到更好地纯化皂苷的作用,还需进一步通 过离子交换树脂等方法进行纯化。本实验目的之一是为了检 测黄瓜籽中总黄酮、总皂苷及总多糖的含量,三种物质中总 多糖的含量高,总皂苷的含量低,其次是得到各有效组 份提取物用于抗骨质疏松作用机理研究。 

 

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