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紫外可见分光光度计高分子结合物含量测定法
时间:2016-04-12 点击次数:1213

紫外可见分光光度计高分子结合物含量测定法

本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖

在不同乙醇浓度下,沉淀分离,采用紫外-可见分光光度

法测定磷含量,计算高分子结合物的含暈。‘

试剂 (1) 5mol/L氯化钠溶液精密称定氯化钠

29.22g,加水溶解并稀释至100ml,室温保存。

(2) 1.5mol/L硫酸于1体积9 8 %的硫酸中加入11

体积的水,混匀。

(3) 2. 5 % 钼酸铵称取钼酸铵2.65g,加水溶解并

稀释至100ml

(4) 1 0 %抗坏血酸称取抗坏血酸10g,加水溶解并

稀释至100ml

( 5 )矿化试剂硫酸与7 0 %髙氯酸等体积混合制得。

( 6 )产色试剂水、1.5mol/L硫酸、2. 5 % 钼酸铵、

1 0 %抗坏血酸,按2 : 1 : 1 : 1体积比混合配制。

(7) 80Mg/ml磷对照品贮备液精密称定经100°C干燥

的磷酸氢二钠0. 3665g或磷酸二氢钾0. 3509g,加水500ml

5mol/L硫酸溶液10ml溶解,补加水至1000ml。临用时,

将贮备液做20倍稀释,即为4Mg/ml磷对照品工作液。

(8) l.Otnol/L氢氧化钠溶液称取4 g氢氧化钠,加

水溶解并稀释至100ml

供试品溶液的制备 1) 分步沉淀原液用生理氯

化钠溶液稀释至多糖含量20?2 % g / m l或成品疫苗3ml,

加人5mol/L氯化钠溶液0.75ml,混匀后加人无水乙醇

1 5 m l ,于一20°C冰箱放置72?96小时,以每分钟8000

4°C离心9 0分钟,吸取上清液为供试品溶液2 ; 于沉淀中

加人50,%乙醇溶液0.5ml,加玻璃珠,混合后室温放置1

小时;再加人5 0 %乙醇溶液1.5ml,混合后室温放置2

时然后以每分钟80008°C离心1小时,吸取1.8ml

清液为供试品溶液3 ; 沉淀再加人l.Omol/L氢氧化钠溶

0.5ml,混合后室温放置1小时,加水1.25ml,作为供

试品溶液4

( 2 )取多糖含量20?的原液或成品疫苗

1.0ml为供试品1

( 3 )供试品溶液的矿化分别量取1.0ml供试品1

1.5ml供试品溶液20.7ml供试品溶液30.5ml供试品

溶液4 2 份;分别加人矿化试剂0. 15ml,置150°C干燥

1小时,然后升温至180°C干燥3 0分钟,再升温至250°C

干燥1小时。

测定法量取水1.95ml,加矿化试剂501后加

2.0ml产色试剂,混匀后置37°C水浴2 小时,在波长

82 5 m n处测定吸光度,作为空白对照。

于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml,加产色试剂

2.0ml,混匀后置37°C水浴2 小时,在波长8 2 5 n m处测定

吸光度。

分别量取磷对照品工作液0.1ml0.2ml0.4ml

0.8ml1.0ml于试管中,每管依次加水1. 85ml1.75ml

1.55ml1.15ml0.95ml;然后每管分别加人矿化试剂

50M1后加2.0ml产色试剂,混匀后置37°C水浴1 小时,

在波长82 5 n m处测定吸光度。

结果计算以憐对照品溶液的浓度对其相应的吸光度

作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度

代人直线回归方程,求出磷含量。

供试品磷含量(y g/ml)分别为:

p^CA.xsy/i.o

P 2 = (A2X18. 75)/1.5

P 3- ( A 3X2.0)/0. 7

P 4 = ( A 4 X2. 0)/0. 5-(P3X10)/100

试验有效性 8 0 % < _ P 1A P 2+ P 3+ 尺)< 1 2 0 %

供试品高分子结合物含量(%) = /(+ P 3+ h ) X

100

供试品游离多糖含量(%)=[1 — P 4/(+ P 3+ P 4 ) ] X

100

式中P ,P 2P 3、尸4 为供试品1,供试品溶液2

供试品溶液3,供试品溶液4 的磷含量;A ,A 2A 3

4为供试品1,供试品2,供试品3,供试品4 中取样矿

化后的磷含量。

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