紫外可见分光光度计高分子结合物含量测定法

本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖

在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用紫外-可见分光光度

法测定磷含量，计算高分子结合物的含暈。‘

试剂 （1) 5mol/L氯化钠溶液精密称定氯化钠

29.22g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。

(2) 1.5mol/L硫酸于1体积9 8 %的硫酸中加入11

体积的水，混匀。

(3) 2. 5 % 钼酸铵称取钼酸铵2.65g，加水溶解并

稀释至100ml。

(4) 1 0 %抗坏血酸称取抗坏血酸10g，加水溶解并

稀释至100ml。

( 5 )矿化试剂硫酸与7 0 %髙氯酸等体积混合制得。

( 6 )产色试剂水、1.5mol/L硫酸、2. 5 % 钼酸铵、

1 0 %抗坏血酸，按2 : 1 : 1 : 1体积比混合配制。

(7) 80Mg/ml磷对照品贮备液精密称定经100°C干燥

的磷酸氢二钠0. 3665g或磷酸二氢钾0. 3509g,加水500ml、

5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。临用时，

将贮备液做20倍稀释，即为4Mg/ml磷对照品工作液。

(8) l.Otnol/L氢氧化钠溶液称取4 g氢氧化钠，加

水溶解并稀释至100ml。

供试品溶液的制备 （1) 分步沉淀原液用生理氯

化钠溶液稀释至多糖含量20?2 % g / m l或成品疫苗3ml,

加人5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加人无水乙醇

1 5 m l ,于一20°C冰箱放置72?96小时，以每分钟8000转

4°C离心9 0分钟，吸取上清液为供试品溶液2 ; 于沉淀中

加人50,%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1

小时；再加人5 0 %乙醇溶液1.5ml，混合后室温放置2 小

时然后以每分钟8000转8°C离心1小时，吸取1.8ml上

清液为供试品溶液3 ; 沉淀再加人l.Omol/L氢氧化钠溶

液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，作为供

试品溶液4。

( 2 )取多糖含量20?的原液或成品疫苗

1.0ml为供试品1。

( 3 )供试品溶液的矿化分别量取1.0ml供试品1、

1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品

溶液4 各2 份；分别加人矿化试剂0. 15ml，置150°C干燥

1小时，然后升温至180°C干燥3 0分钟，再升温至250°C

干燥1小时。

测定法量取水1.95ml，加矿化试剂50卩1后加

2.0ml产色试剂，混匀后置37°C水浴2 小时，在波长

82 5 m n处测定吸光度，作为空白对照。

于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml，加产色试剂

2.0ml,混匀后置37°C水浴2 小时，在波长8 2 5 n m处测定

吸光度。

分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、

0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1. 85ml、1.75ml、

1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分别加人矿化试剂

50M1后加2.0ml产色试剂，混匀后置37°C水浴1 小时，

在波长82 5 n m处测定吸光度。

结果计算以憐对照品溶液的浓度对其相应的吸光度

作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度

代人直线回归方程，求出磷含量。

供试品磷含量（y g/ml)分别为：

p^CA.xsy/i.o

P 2 = (A2X18. 75)/1.5

P 3- ( A 3X2.0)/0. 7

P 4 = ( A 4 X2. 0)/0. 5-(P3X10)/100

试验有效性 8 0 % < _ P 1A P 2+ P 3+ 尺）< 1 2 0 %

供试品高分子结合物含量（％) = 巧/(朽+ P 3+ h ) X

100

供试品游离多糖含量（％)=[1 — P 4/(朽+ P 3+ P 4 ) ] X

100

式中P ,、P 2、P 3、尸4 为供试品1，供试品溶液2，

供试品溶液3，供试品溶液4 的磷含量；A ,、A 2、A 3、

八4为供试品1，供试品2，供试品3，供试品4 中取样矿

化后的磷含量。