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上海奥析科学仪器有限公司紫外分光光度计测
时间:2016-08-31 点击次数:1077

3 1 0 2唾液酸测定法

(间苯二酚显色法)

本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状

态,游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物,再

用有机酸萃取后,测定唾液酸含量。

睡液酿对照品溶液(200pg/inl)的制备精密称取唾液

酸对照品10.52mg(lMg 唾液酸相当于3. 24mnol),置10ml

量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,混匀,即为唾液酸贮备液

( lm g /m l) ,按一次使用量分装,一7CTC贮存,有效期1 年。

仅可冻融1次。4°C保存使用期为2 周。精密量取唾液酸贮

备液l m l ,5m l量瓶中,加水至刻度,即为每lm l

200Mg 的唾液酸对照品溶液,用前配制。

用于C 群脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗唾液酸含量测定时,

同法制备浓度为400Mg /m l的唾液酸对照品溶液贮备液(精

密称取唾液酸40mg,置100ml量瓶中,用纯化水溶解并定

容至刻度,混匀,即得)。精密量取唾液酸贮备液2.0ml

10ml量瓶、中,加水至刻度,即为每lm l含唾液酸80邶的

唾液酸对照& 溶液,用前配制。

测定法取供试品适量,加水稀释至蛋白质浓度为每

. 226 .

lm l0.2.0.4mg,作为供试品溶液。按下表取唾液酸对

照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中,混匀,每

管再加人间苯二酚-盐酸溶液(分别量取2% 间苯二酚溶液

2.5ml0. lm o l/L 硫酸铜溶液 62. 5^125% 盐酸溶液 20ml

加水稀释至25ml,混勻。试验前4 小时内配制)lm l,加盖,

沸水煮沸3 0分钟(水浴面高于液面约2cm),取出置冰浴中3

分钟(同时振摇)后,每管加乙酸丁酯-丁醇溶液(取4 体积乙

酸丁酯与1 体积丁醇混匀,室温下保存,1 2小时内使用)

2ml,充分混匀,室温放置1 0分钟,照紫外-可见分光光度

法(通则0401),在波长580nm处测定吸光度。

唾液酸含量(Mg)

供试品

空白2 4 5 6 8

唾液酸对照品溶液(1) 10 20 25 30 40

( Ml) 100 90 80 75 70 60

供试品溶液( Ml) 100

脑膜炎球菌疫苗唾液酸含量测定:取含唾液酸约4CVg/ml

的供试品溶液和纯水对照各2ml, 另分别取唾液酸对照品

(80/^g/ml) 0. lm l0.2ml0_4ml0_ 8ml1.6ml 于各管中,

补水至2O m l为标准曲线各点。各管加2 m l显色剂

(0. lm o l/L硫酸铜溶液0.5ml4%间苯二酚溶液5ml,浓盐

80ml,补水至100ml混匀。临用现配)摇匀,沸水浴15

分钟后冰浴5.10分钟,每管加4m l有机相(正丁醇15ml

加乙酸丁酯定容至100ml),充分摇匀后置室温10分钟。以

纯水对照为0 点,于585nm测定吸光度,并作直线回归。

(可按比例缩小供试品及各试剂体积)

以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回

归(相关系数应不低于0 .99),由直线回归方程计算5Mg 唾液

酸的吸光度值,再按下式计算供试品唾液酸含量。

促红素供试品唾液酸含量— A 2X 5X3. 2A XW X n

(mol/mol 蛋白质) A7XPXTOO

式中烏为5Mg 唾液酸的吸光度;

A 2为供试品的吸光度;

. 为供试品稀释倍数;

P 为供试品蛋白质含量,Mg /p l;

W lrn n o l促红素的量(不包括糖成分量),相当

30. 6/xg0

脑膜炎奈瑟球菌多糖疫苗供试品唾液酸含量(/ x g /m l) =

A X nA 为供试品溶液吸光度相对于唾液酸对照品溶液的浓

度,fig /m li

n 为供试品的稀释倍数。

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