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双光束紫外可见分光光度计测定 DNA 的含量
时间:2017-05-27 点击次数:790

   双光束紫外可见分光光度计测定 DNA 的含量 

 

  双光束紫外可见分光光度计法测定核酸的含量,操作简便、 快速、 灵敏、 用量少、 对样品无损害,是一种常用的核酸测定方法。 

一、实验原理 

DNA  RNA 都有吸收紫外光的性质,它们的zui大吸收峰在波长 260 nm 处。这是嘌呤 环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,凡是含有嘌呤和嘧啶的一切物质,不论是核苷、核苷酸,均具有吸收紫外光的特性。核苷和核苷酸的摩尔消光系数ε (P)(或吸收系数)表示为每升溶液中含有 1 mol 原子磷的消光值(即光密度或称光吸收值)RNA 的ε (P)260 nm (pH 7.0)77007800RNA 的含磷量约 9.5 % ,因此,每毫升溶液含 1μg RNA 的光吸收值相当于0.024。计算如下

原子磷量: 1 mol / L = 31 g / 1000 mL = 31 mg / mL(磷相对原子质量:31) RNA : 31 mg / mL÷9.5 % = 330 mg / mL 1 mg / mL RNA 的光吸收值: 7800÷330 = 24 1μg / mL RNA 的光吸收值: 0.024 再如,小牛胸腺 DNA 钠盐的ε (P)2 60 nm (pH 7.0) 6600,含磷量为9.2 %  因此,每毫升溶液含 1μg DNA 钠盐的光吸收值为 0.020。由于蛋白质分子中含有芳香族氨基酸,因此,也具有吸收紫外光的特性。通常蛋白质的zui大吸收峰在波长 280 nm 处,而在 260 nm 处的吸收值仅是核酸的 1 / 10 或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时,用紫外法测定核酸含量的影响不大。RNA 260 nm  280 nm 的光吸收比值在 2.0 以上,DNA  260 nm  280 nm 光吸收的比值在 1.9 左右。当样品中蛋白质含量较高时,比值下降。 

二、器材与试剂 ()、器材 

25 mL 50 mL容量瓶,离心机,  UV1901PC双光束紫外可见分光光度计

 ()、试剂 

DNA 溶液的配制: 20 mg 猪脾 DNA 钠盐制品,先用少量0 .1 mol / L NaOH 使其溶解,用0.05 mol / L NaOH 溶液定容至 25 mL,浓度为0.8 mg / mL 

三、实验步骤 

()DNA 光吸收曲线的绘制 

准确吸取0.5mL DNA 溶液(0.8 mg/mL)置于 25 mL容量瓶内,用蒸馏水定容至25 mL(稀释50)。取 3 mL 在紫外分光光度计上测定 220300 nm的光吸收曲线(见图1)。由光吸收值 A2 60 nm可直接计算出 DNA 的含量。 

猪脾 DNA 的紫外光吸收曲线与小牛胸腺 DNA 紫外光谱基本一致。 

()DNA 的含量测定 

将样品配成 550μg / mL 的核酸溶液,在UV1901PC双光束紫外可见分光光度计上测定波长260 nm 280 nm的光吸收值,根据以下公式计算核酸的浓度和光吸收的比值。 

RNA 浓度(μg / mL) =A260 nm×稀释倍数/0.024×比色杯厚度(cm) DNA 浓度(μg / mL) =A2 60 nm×稀释倍数/0.020×比色杯厚度(cm) 式中的 A2 60 nm为波长 260 nm 处的光吸收读数。 

如果待测样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的寡核苷酸,在测定时需要用钼酸铵-过氯酸沉淀剂沉淀,除去大分子核酸。具体操作如下: 

取两支小离心管,甲管加0.5mL 样品和0.5mL 蒸馏水,乙管加入0.5mL 样品和0.5mL钼酸铵-过氯酸沉淀剂,摇匀后,放置冰浴中30 min,以3000 r / min 离心10 min,从甲、乙两管中分别吸取0.4mL 上清液到两个50 mL 容量瓶内,定容至刻度,于UV1901PC双光束紫外可见分光光度计上测定波长260 nm 的光吸收值。 

RNA( DNA)浓度(μg / mL) =测得的吸光值差(ΔA26 0 n m )× 稀释倍数/0.024( 0.020)× 比色杯厚度(cm) 

式中ΔA260 nm为甲管稀释液在波长 260 nm 处的吸收值减去乙管稀释液在波长 260 nm 处的吸收值。 

核酸含量( % ) =待测液中测得的核酸μg/待测液中待测品的μ ×100

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