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紫外可见分光光度计测蛋白质分子
时间:2016-08-17 点击次数:880

第二法福林酚法(1^ * 17>

本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与

C u 2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼

酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在

一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对

照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的

含童。

本法灵敏度高,测定范围为20.25C^ g。但对本法产生

干扰的物质较多,对双缩脲反应产生干扰的离子,同样容易

干扰福林酚反应,且影响更大。如还原物质、酚类、枸橼

酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘

油等均有干扰作用。

除另有规定外,按方法1操作;如有干扰物质时,除另

有规定外,按方法2操作并需经方法学验证。

方法1:

试剂碱性铜试液取氢氧化钠I0 g,碳酸钠50g,加

400ml使溶解,作为甲液;取酒石酸钾0.5g,加水50ml

使溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30ml使溶解,将两液混

合作为乙液。临用前,合并甲、乙液,并加水至500ml

对照品溶液的制备除另有规定外,取血清白蛋白(牛)

对照品或蛋白质含量测定国家标准品,加水溶解并制成每

lm l中含0. 2mg的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋

白质浓度应与对照品溶液基本一致)。

测定法精密量取对照品溶液0.0ml0.2ml0.4ml

0. 6mK 0.8ml1. Oml(对照品溶液取用量可在本法测定范

围内进行适当调整),分别置具塞试管中,各加水至l.Otnl,

再分别加入碱性铜试液1 .0 m l,摇匀,室温放置1 0分钟,

各加人福林酚试液[ 取福林试液中的贮备液(2m o l/L酸浓

度)116] 4 .0 m l,立即混匀,室温放置3 0分钟,照紫外-

可见分光光度法(通则0401),在650mn的波长处测定吸光

度;同时以0 号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应

的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量,

同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓

度,并乘以稀释倍数,即得。

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