UV1901PC紫外可见分光光度计检测蛋白质的方法

紫外可见分光光度计简介：

随着现代科技的不断发展和进步，现代分光光度的测试手段和方法都在不断改进，但zui根本的依据仍然建立在朗伯-比尔定律的基础之上。

A=KLC

式中：

A-为被测物在给定波长的需光吸光度值

     K-为一系数，称为溶液的吸收系数（与入射光波长及被测物质的特性有关）

     L-为被测物质的厚度（一般与比色池的厚度有关）

     C-为被测物质的浓度

    由上式可以看出，被测物质对单色光的吸光度与被测物质的浓度成正比。

实际测试时，单色光通过被测物质达到光电接收器中，由光电倍增管或光电池转换成光电流，而光电流的强弱决定了吸光度值A的大小。假定通过参比样品的光电流为I。，而通过待测样品的光电流为I，则两者之比设定为τ，也称透射比（或以T%表示，称为透过率）。则：

τ=I/ IO×100%

朗伯-比尔定律的贡献就是发现了透射比的负对数值（也就是吸光度A）的变化与物质的浓度的变化呈正比关系。即：

A=-lgτ或lg（IO/I）=KCL

    同时，不同的物质对不同波长的单色光呈现出不同的吸光度值，这一变化特征也就是分光光度法用于物质的定性定量分析的理论基础。

基于上述原理，就可以知道无论是以往的仪器还是现在的仪器，其zui基本的工作要求都是能准确获得物质（或称样品）在某一波长的透射比或在某一个光谱波长范围的吸光度变化特性（具体说光谱特性谱图）。而UV1901PC/UV1902PC双光束紫外可见分光光度计，能同时测量参比样品和待测样品。由于参比样品和待测样品是同时测量的，所以任何由光源带来的影响都被抵消了，从方法上保证了测量度。

UV1901PC紫外可见分光光度计检测蛋白质的原理：

根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比.

蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275—280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在zui大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 

蛋白质浓度（mg/mL）=1.4280-0.74A260  

(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d 

其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子 

（4）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式： 

蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225） 

（A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值。

仪器与试剂 

仪器：uv-1901pc紫外-可见分光光度计

UV1901PC紫外可见分光光度计特点：

采用滨松无臭氧环保型氘灯，普通长寿命氘灯会有臭氧产生，长期吸入对身体有害，无臭氧长寿命氘灯就可以有效避免。仪器还采用德国欧士朗钨灯，美国派来芝检测器，双光束光学系统，加厚光学底板，更能保证仪器的稳定性。操作界面和操作系统都是简便快捷版的，减少了检测时间的同时，增加准确性.吸光度可以到小数点后四位。可选配多种附件，自动四联池，七联池，恒温装置，透过率固体架，反射率固体架等。

比色管（10ml的5个），吸量管。 试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。

实验过程：

启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。 

用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）. 

在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描） 

将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。 

附加：吸收曲线的制作:（找出zui大吸收波长） 

将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的zui大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为   。  

标准曲线的制作： 

在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。 

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：

样品测定： 

配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.3906，0.3765，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。