UV1901PC紫外可见分光光度计测二羟基丙酮含量

二羟基丙酮(1,3-dihydroxyaceton，简称DHA，1)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，对人体和环境无毒害，可食用。1是一种重要的医药中间体，也可作为一种抗病毒试剂 [1]。1能与皮肤zui上层物质（如角质层内的氨基酸）发生Maillard反应使皮肤达到棕色到深色的染色效果。根据这一原理1在临床上被广泛应用于治疗白癫风[2]，它也被用来做为混合型卟啉病的保护剂[3]。还有研究表明在紫外照射下1能延缓皮肤癌变[4]。

1的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法，国外比较成熟的工业生产主要是用含有甘油脱氢酶的微生物以甘油底物发酵生产。目前，发酵液中1检测方法有气相色谱法[5]、液相色谱法[6]、薄层层析法[7]。气相色谱法测定时1不能直接汽化，需要进行衍生化，操作繁琐；液相也比较耗时。薄层层析法只能定性分析，无法定量。在酸性溶液中1的酮基与二苯胺（diphenylamine，2）的氨基发生反应生成蓝色复合物，在608 nm处吸光度与1的浓度呈线性关系，在酸性条件下，2不与甘油发生反应。

图1 2分光光度法反应原理

1  仪器与试剂

UV1901PC型紫外可见光分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）

1（Bio Basic公司）；2（上海试剂三厂）；无水乙酸；浓硫酸；甘油；酵母粉；磷酸二氢钾。

菌种：葡糖杆菌Gluconobacter sp. HD 410，由河南大学生物工程研究所筛选并保藏。发酵培养基成分：甘油10%，酵母粉1.5%，无水KH2PO4­ 0.5%，pH自然。

2  方法与结果

2.1 溶液配制

1溶液：准确称取1 1 g，于1000 ml容量瓶中定容，制成1 g/l 母液，分别加蒸馏水配制成0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 g/l的1梯度溶液。

2溶液：准确称取2 0.6 g，量取无水乙酸54 ml边搅拌边加入浓硫酸 6 ml，混匀后加入称取的2，至*溶解后密封保存。

2.2  2分光光度法测定1

标准曲线绘制：分别取0.5 ml 1梯度溶液，4.5 ml 2溶液，于比色管中沸水浴14 min，流水冷却。以不含1的溶液为空白参比，UV1901PC紫外可见分光光度计608 nm处测样品的吸光值。每个样品三次重复，取平均值。

2.3发酵液1含量测定：取对数期种子液，按5%的接种量接入摇瓶。200 r/min，28°C发酵3~4 d，取发酵液1.5 ml，8000 g离心10 min。取上清液0.5 ml用蒸馏水稀释100倍，取0.5 ml稀释液加入4.5 ml 2溶液，沸水浴14 min，流水冷却。以未接种发酵液为空白，在608 nm处测吸光值，根据标准曲线计算发酵液中1含量。

2.4 甘油浓度测定

用高碘酸氧化法[8]测发酵液中甘油的含量。

2.5 测定条件研究

2.5.1 测定波长的选择

按2.2方法以蒸馏水为空白参比扫描不同1浓度400～700 nm的吸收光谱。每个样品三次重复。

是保持同样的的2溶液浓度，仅改变1浓度得到的一系列吸收光谱。从图2中可以看出，在608 nm波长处显色反应有zui大吸收值，且吸光度的增加与1溶液浓度的增加成正比。尽管在405 nm波长处显色反应也有吸收峰，但峰值较低，因而本法zui终选择测定波长为608 nm (OD608)。

图2不同1浓度吸收光谱

2.5.2 显色剂用量的选择

取0.2 g/l 1溶液0.5 ml，分别加入含不同浓度的2溶液，显色反应后流水冷却，测定吸光度OD608。由图3A得出结论，2含量高于1%（w/v）时吸光值不再增加，用量过少导致1与其不能充分反应，所测结果比实际偏低，故本法zui终选择的显色剂用量为1%（w/v）

 A不同浓度2对吸光值的影响；  B不同浓度浓硫酸含量对吸光值的影响；

C不同温度对吸光度的影响；    D反应时间对吸光值的影响

2.5.3 硫酸用量的确定

在酸性条件下1才能与2结合，生成蓝色的复合物。由图3B得出结论，浓硫酸含量为10%时生成的蓝色复合物吸光值达到zui大。浓硫酸加入量不足或过多均导致吸光值偏低，且硫酸加入量过多会使反应冷却后吸光值不稳定。

2.5.4 加热温度的选择

常温下2与1反应很慢，3C表明，在沸水浴条件下，生成的复合物吸光值zui大，用冷水冷却后吸光值稳定。

2.5.5 加热时间的选择

沸水浴条件下反应需一定的时间1才能与2充分反应，3D表明，沸水浴14 min后，吸光值zui大，且吸光值稳定，有利于准确测定；随着加热时间的增加，吸光值略有降低，冷却后吸光值不稳定。因而，本法选用的沸水浴时间为14 min。

2.6  测定方法的影响因素

2.6.1   显色稳定时间的选择

取不同浓度1溶液与显色剂反应后，在不同时间测定吸光值，试样溶液在显色完成至12 h内吸光值稳定，表明本方法显色稳定性良好。

2.6.2 相关影响因素研究

取发酵72 h的发酵液与未接种的培养基，8000 g离心10 min。取0.5 ml未接种培养基，以水为空白对照测吸光值，培养基在OD608值为0。结果说明甘油和培养基中的杂质对该测定方法没有影响。

量取1 ml离心上清液，加入4 ml无水乙醇[9]，摇匀，离心后吸上清加蒸馏水稀释100倍，测其吸光值。与未加乙醇沉淀蛋白质的发酵液相比，二者吸光值没有显著的差别。结果表明菌体自溶产生的可溶性蛋白对该检测方法影响不大。

2.7  线性范围及检测限

按“2.2”项下方法分别配制不同浓度的1溶液进行标准曲线绘制，结果表明1的浓度在0.5 g/l以内时，吸光度（A）与质量浓度（c）呈线性关系。1浓度为0.1～0.4 g/l时，0.2≤ OD608 ≤0.8，回归方程为A=0.00855+1.9095c (r2=0.999)，线性良好。

2.8 精密度、回收率及准确度实验

取发酵液待测样品，按照10 g/l和15 g/l的量精密加入1，按“2.2”项下方法反应后测定1的含量（重复测定五次），结果见表1所示，本方法的平均回收率和RSD均在正常误差范围之内。

表1   精密度和回收率测定（n=5）

此外，对样品还进行了分光光度法和HPLC法测定的对比实验，以测定该法的准确度。将含有不同浓度1（10~100 g/l）的发酵液稀释后分别按照“2.2”和“2.3”项中方法分别进行测定。实验结果表明，两种方法的测量误差在2%以内，进一步证明本测定方法不受发酵液中甘油杂质的影响，具有相对较高的准确度。

2.9  发酵液中1浓度变化曲线的测定

按照“2.2”项中的方法，测定发酵液中1浓度变化曲线，并同时测定甘油的浓度变化（方法见“2.4”项），结果如图4。从图中可以看出，随着发酵时间延长，底物甘油呈下降趋势，在微生物分泌的酶作用下被转化成产物1，108 h时1产量达到64.5 g/l，转化率达到79.6%（1/甘油，w/w）。

  甘油转化生成1曲线

3. 讨论

本文建立了用2分光光度法测定甘油为底物的发酵液中1含量的方法。测定*波长选为608 nm，2*浓度为1%（w/v）；沸水浴加热时间14 min。该方法测定过程不受发酵液中甘油和可溶性蛋白影响，具有显色稳定、测量快速准确的优点，非常适合于微生物发酵法生产1工艺中的产物测定。

结论：甘油为底物发酵液中二羟基丙酮的分光光度检测方法。考察显色剂的用量、反应温度、反应时间、显色稳定时间、发酵液成分和发酵液中菌体自溶物等对测定的影响。该方法的相关系数R2=0.999，检测范围0.1～0.4 g/l，样品回收率达102.4%，测定结果不受发酵液中甘油及其它杂质影响，具有快速准确的优点。